Utilisation de la souris BLT humanisé comme une tumeur de cellules souches Gene Therapy modèle basé sur

L'objectif général de l'expérience suivante est de générer des souris portant un système immunitaire humain modifié. Cela est réalisé en préparant d'abord la souris pour une intervention chirurgicale, puis en chargeant le trocart avec un fragment de thymus lors de la deuxième étape. Le Matrigel est mélangé avec des cellules transduites CD 34 négatives et CD 34 positives, et le mélange est ensuite ajouté au trocart.

Ensuite, les constructions en matrigel sont transplantées sous la capsule rénale. En fin de compte, le rejet des tumeurs cibles par les lymphocytes T CD8 génétiquement modifiés peut être surveillé par imagerie TEP in vivo et par des mesures physiques des tumeurs. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les modèles entièrement murins réside dans sa capacité à permettre l'étude du développement de cellules souches humaines modifiées génétiquement au sein du thymus humain, ainsi que le test d'efficacité in vivo des lignées dérivées. La procédure sera démontrée par trois techniciens de nos laboratoires : Gregory Bristol, Bernard Levin et Sean Kim.

Dans ce schéma, le modèle BLT modifié utilisé dans ces études pour la génération de souris chimériques portant mart, un lymphocyte T spécifique, est décrit. L'implant th est reconstruit à partir de cellules CD 34 transduites et non transduites isolées d'un foie fœtal autologue. Une fraction des cellules transduites est ensuite congelée et injectée dans les souris irradiées quatre à six semaines plus tard.

Dans cette vidéo, l'implantation du greffon vivant est démontrée une fois que les animaux sont devenus apathiques sous l'effet de l'anesthésie. Commencez par raser le côté gauche de chaque souris, de la hanche à l'épaule, entre le milieu du dos et le ventre. Après avoir noté le poids de chaque animal, percez leurs oreilles pour la numérotation et injectez par voie sous-cutanée 0,3 millilitre de carprofène dans chaque épaule.

Ensuite, placez les souris sur leur côté droit, tournées vers la gauche. Rincez maintenant le trocart d'une aiguille d'implantation de cancer de calibre 16, dotée d'une pointe en lime ronde, avec du PBS. À l'aide d'une pince fine, ajoutez un morceau de thym dans la boîte contenant du PBS, puis maintenez le trocart horizontalement avec la tige.

Aspirez le tissu juste à l'intérieur de la pointe. Faire glisser le trocart sous la capsule rénale et injecter le tissu constitue l'un des aspects les plus délicats de cette procédure. Ensuite, faites appel à un assistant.

Utilisez une pipette à déplacement positif de type eend pour mélanger délicatement cinq microlitres de matrigel froid dans un tube de cellules en remuant doucement. Maintenez le trocart à l'horizontale. Ramenez lentement la tige vers l'arrière pendant qu'un assistant pipette le matrigel.

Mélanger dans le trocart pour chaque souris. Commencez par passer de la Bétadine sur la peau nue de l'animal, puis essuyez-la avec un tampon d’isopropanol. Repérez à deux reprises l’endroit le plus foncé sous la peau, indiquant l’emplacement de la rate.

Le rein se trouve à environ cinq millimètres en direction dorsale par rapport à la rate à l’aide de pinces contondantes pour soulever la peau au-dessus du rein. Effectuez une incision d’environ 15 millimètres de long dans la peau parallèlement à la rate. Réalisez une incision similaire dans la couche musculaire du péritoine située en dessous.

Chez les mâles, le rein doit être directement visible. Il suffit de presser l'abdomen pour le faire sortir. En maintenant une pression sur l'abdomen avec la main gauche afin de garder le rein exposé, chez les femelles, utilisez d'abord un clamp hémostatique pour saisir l'ovaire, puis tirez doucement le rein pour aider à maintenir l'organe à l'extérieur du corps.

Percez un petit trou à l’extrémité postérieure de la capsule rénale, puis faites glisser le trocart dans cette ouverture et le long du rein jusqu’à ce que l’orifice du trocart soit complètement recouvert par la capsule rénale. Ensuite, à l’aide du petit doigt de la main droite, injectez le tissu. Utilisez maintenant le clamp hémostatique fermé pour repousser doucement le rein en place.

Faire un point de suture dans le péritoine avec un nœud double, en pinçant la peau comme une bourse, puis appliquer deux agrafes de plaie. Enfin, déposer une goutte de PBS sur chaque œil et placer la souris sur le côté dans une cage, sur de la litière. Après avoir implanté toutes les souris de la même manière, s'assurer que les animaux sont revenus en position couchée sur le ventre avant de les laisser.

Cette première figure montre une image représentative de l'implant THI vivant chez des souris humanisées. Sur cette figure, le développement normal du tissu thymique et la distribution physiologique des lymphocytes T positifs pour les marqueurs humains CD four et CD eight sont démontrés. Après reconstitution, les animaux possèdent un système immunitaire humain avec une répartition normale des lymphocytes T positifs pour les marqueurs CD four et CD eight.

Ici, une image représentative d'une souris portant une tumeur mélanome est présentée. Les zones grises indiquent l'image du scanner CT. Les zones colorées indiquent l'activité métabolique de la tumeur telle qu'elle est détectée par le scanner PET.

Le scanner CT seul dans cette expérience a révélé une masse tumorale importante dans la zone indiquée par le cercle blanc. Toutefois, comme l'illustre l'imagerie TEP in vivo, cette zone se compose principalement de tissu nécrosé et de tissu cicatriciel, soulignant ainsi l'utilité de l'imagerie TEP comme méthode plus sensible et plus précise pour évaluer la régression et l'élimination de la tumeur. Après cette procédure, d'autres tests tels que l'analyse des lymphocytes T, le phénotypage et l'activation ex vivo peuvent être réalisés afin de répondre à des questions relatives à la fonction des lymphocytes T.