Une procédure optimisée pour Fluorescence-activated tri cellulaire (FACS) Isolement du système nerveux autonome progéniteurs neuronaux de viscères de souris sur le fœtus

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une population de progéniteurs neuronaux purifiés à partir de ganglions du système nerveux périphérique. Cela est réalisé en disséquant d'abord l'organe ou les ganglions spécifiques d'intérêt chez des souriceaux fœtaux. Les tissus sont ensuite partiellement dissociés afin de libérer les cellules individuelles dans le milieu environnant.

Ensuite, la suspension cellulaire est filtrée pour éliminer les agrégats tissulaires résiduels ou les agrégats de grande taille. Enfin, la suspension cellulaire est triée par cytométrie en flux afin d'isoler la population d'intérêt en fonction de l'expression d'un marqueur fluorescent dans cette population cellulaire. En définitive, les profils d'expression génique peuvent être comparés entre des progéniteurs isolés à différents stades de développement, ou entre des populations purifiées de différents types cellulaires neuronaux.

Le principal avantage de cette technique par rapport à l'isolement de populations cellulaires basé sur l'étiquetage par anticorps est que les réactifs immuno sont souvent indisponibles. Les lignées de souris génétiquement modifiées produisant une protéine fluorescente dans des sous-ensembles neuronaux spécifiques permettent l'isolement de ces populations cellulaires. Bien que nous démontrions cette méthode pour l'isolement de progéniteurs neuronaux provenant de l'intestin et de la voie neurogène de la bouche, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes modèles exprimant des marqueurs fluorescents.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car elles ont tendance à sur-digérer les tissus d'origine, ce qui entraîne une perte de viabilité cellulaire. Avant de commencer la dissection, observer les embryons en éclairage clair pour s'assurer que les structures pertinentes sont bien au point. Puis identifier les embryons positifs pour le transgène en recherchant l'expression du marqueur fluorescent à l'aide d'un microscope stéréo à fluorescence.

Après l'euthanasie, commencer par ajouter une quantité minimale de PBS dans la boîte de dissection, afin que l'embryon ne flotte pas pendant la dissection des tissus. Ouvrir la peau de l'embryon sur les côtés du corps et au niveau de l'abdomen, à la hauteur du foie. Retourner l'embryon sur le dos et utiliser une pince fine pour le fixer en place.

Au niveau des membres antérieurs, insérez une autre paire de forceps au niveau du diaphragme, puis tirez vivement les organes internes vers la queue et éloignez-les de la paroi corporelle dorsale afin d'extraire les viscères, du foie jusqu'au tubercule génital. Si des organes de la cavité thoracique, tels que le cœur ou les poumons, sortent en restant attachés aux viscères, retirez-les avant de continuer.

Une fois les viscères abdominaux séparés de la carcasse, insérez une paire de forceps sous le foie, près de l'estomac, et détachez délicatement le foie de l'intestin. Ensuite, disséquez soigneusement l'intestin postérieur de l'urètre dorsal et retirez l'intestin du tractus urogénital. Enfin, retournez l'intestin afin que la rate soit visible sous l'estomac.

Retirer la rate et le pancréas. Séparer les boucles de l'intestin en tenant le mésentère. Puis détacher le mésentère et les vaisseaux sanguins associés de l'intestin en tirant doucement sur le mésentère.

Évitez de tenir directement l'intestin avec la pince. Si l'intestin se rompt, regroupez simplement les morceaux séparés lors de l'étape de dissociation. Rassemblez chaque type de tissu dans un tube conique de 15 millilitres contenant du HBSS glacé, en fonction du type de tissu et du phénotype de l'embryon.

Après la centrifugation, aspirez autant que possible le milieu HBSS des tissus sous-dissectés. Resuspendez ensuite le culot tissulaire dans un à plusieurs millilitres d'ACU max. En changeant systématiquement les embouts de pipette entre chaque échantillon.

Pour éviter la contamination croisée entre les types de tissus, placez les tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 20 à 45 minutes. Selon le stade du tissu à isoler, la dissociation et la filtration du tissu constituent la partie la plus délicate de la procédure afin de prévenir une dissociation excessive du tissu, et par conséquent, une faible viabilité cellulaire.

Limiter le temps de dissociation et ne pas chercher à dissocier complètement tous les fragments de tissu à mi-chemin. À la fin du temps de dissociation, fragmenter manuellement le tissu en frappant vigoureusement le tube contre le bord du bain-marie et en le projetant vers le bas avec un mouvement sec du poignet. Placer ensuite les échantillons dissociés sur de la glace et ajouter immédiatement un millilitre de solution de blocage fraîchement préparée dans chaque tube, en utilisant une nouvelle pipette pour chaque échantillon. Aspirer et expulser l’échantillon plusieurs fois jusqu’à ce que le tissu soit presque complètement dissocié.

À l’aide d’une paire de pinces stérilisées à l’éthanol, placez un carré de 3 cm de membrane en nylon de 38 microns sur l’ouverture d’un nouveau tube conique de 15 millilitres. Ensuite, utilisez des embouts de faible diamètre pour filtrer, par pipetage au centre de la membrane, la solution individuelle de cellules remises en suspension à travers cette membrane. Une fois la suspension cellulaire filtrée, rincez le tube d’échantillon avec un millilitre de solution d’arrêt « quench one to five » et filtrez toutes les cellules restantes.

Ensuite, retirez la membrane en faisant attention d'empêcher tout échantillon de tissu non filtré d'entrer dans le tube. Après la centrifugation, aspirez le surnageant des suspensions cellulaires et resuspendez le culot dans un millilitre de solution d'arrêt un à cinq. Puis, filtrez chaque suspension cellulaire à travers un tamis en nylon dans des tubes en polystyrène de cinq millilitres, comme vient d'être montré.

Commencez par réserver une petite aliquote de l'échantillon de fluorescence pour le témoin de compensation uniquement EGFP. Ensuite, divisez l'échantillon de tissu de type sauvage en deux portions, en étiquetant l'une « type sauvage uniquement » et l'autre « sept A a d.Only ». Remplissez ensuite tous les tubes d'échantillons avec le réactif d'extinction 1 à 5, puis, après centrifugation des échantillons, aspirez tout le surnageant sauf les derniers 200 microlitres dans chaque tube.

Enfin, ajoutez sept A a D aux échantillons à trier ainsi qu'au témoin contenant uniquement sept A a D. Ajoutez ensuite 0,75 millilitre de triazole LS à une microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Pour la collecte des échantillons, commencez par utiliser les témoins afin de régler les paramètres de compensation et les fenêtres d'analyse pour éviter les cellules mortes positives pour sept A a D et pour recueillir les cellules présentant une forte intensité de fluorescence GFP.

Après avoir réglé les paramètres de compensation, commencez le tri à la pression la plus faible possible, avec un embout à large diamètre et un débit faible. Récupérez un maximum de 25 000 cellules dans chaque tube de microcentrifugeuse afin que le triol LS ne soit pas trop dilué. Immédiatement après le tri, vortexez chaque tube contenant les cellules capturées dans le triol LS.

Dans cette première figure, un tractus génital entier de souris observé en vue ventrale sous éclairage en champ clair à 15,5 jours post-coïtus est présenté ici. Le même échantillon est observé en fluorescence afin de montrer la distribution des cellules EGFP positives dans les glandes surrénales et les ganglions coeliaques situés en position médiale, identifiés par leur expression du transgène TH-EGFP. Cette vue latérale d'une vessie de souris TH-EGFP disséquée à 15,5 jours post-coïtus montre la fluorescence provenant de l'expression du transgène dans les ganglions pelviens, la paroi de la vessie et l'urètre.

Dans cette vue dorsale du même échantillon, des cellules positives pour l'EGFP sont visibles dans les tissus de l'urètre dorsal antérieur. La dissociation de ces tissus pour produire des suspensions cellulaires destinées au tri en flux est un équilibre délicat entre une digestion enzymatique adéquate et l'évitement d'une sur-digestion, qui peut entraîner une faible viabilité cellulaire. Ces microphotographies montrent des tissus du tractus urogénital inférieur et de l'intestin à mi-chemin du temps de dissociation. Comme on peut le voir sur ces photos de tissus correctement digérés avant et après une dissociation manuelle, des fragments triangulaires d'organes sous-dissectés sont encore clairement visibles dans des tissus traités enzymatiquement trop longtemps ou à une concentration trop élevée d'enzyme.

Cependant, la suspension obtenue ne contient aucun fragment tissulaire résiduel ; une dissociation appropriée et un filtrage manuel produisent des profils de cytométrie en flux qui présentent généralement plus de 90 % de cellules viables, et dans cette population viable, les cellules exprimant le marqueur conservent une forte intensité d'expression d'EGFP. La population noire est composée de cellules simples mortes, marquées par l'incorporation du colorant fluorescent seven a a d. La population grise est constituée de cellules simples, définies par la diffusion avant et latérale, qui ont exclu seven a a d et sont donc viables.

La population verte provient de la zone positive sélectionnée pour GFP et est constituée de cellules uniques viables ayant exclu le colorant seven AAD, et présentant une fluorescence EGFP. Grâce à cette procédure, l'isolement de progéniteurs neuronaux à partir d'autres tissus périphériques, tels que la chaîne sympathique, les ganglions de la racine dorsale ou le poumon, peut être réalisé afin de répondre à des questions portant sur les différences de profils d'expression génique entre populations ou sur le développement de lignées distinctes.