La purification et l'agrégation de la protéine précurseur amyloïde domaine intracellulaire

L'objectif de cette procédure est de purifier le domaine intracellulaire du précurseur de l'amyloïde, également connu sous le nom de A ICD, et de présenter un protocole d'agrégation thermique et de caractérisation du A ICD par microscopie à force atomique. Cela est réalisé en exprimant d'abord une fusion A GST du A ICD dans des bactéries. Ensuite, la protéine G-S-T-A-I-C-D est purifiée, clivée à l'aide de la thrombine pour séparer le GST du A ICD, puis le GST est éliminé.

Ensuite, l'agrégation thermique de l'ICD A est induite. Enfin, les agrégats d'ICD A sont visualisés par microscopie à force atomique. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent que l'ICD A peut être purifié à l'état homogène en quantité suffisante pour des analyses biochimiques et biophysiques.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, qui nécessitent des étapes complexes de chromatographie, est qu'un ICD hautement pur et soluble peut être isolé sur un plan de travail à l'aide de réactifs et d'équipements standards. Un ICD produit selon ce protocole convient à une caractérisation biochimique et biophysique ultérieure.

La procédure sera démontrée par Amina ti. L'ancien postdoctorant de mon laboratoire, le Dr. Andres Oberer, montrera comment réaliser l'imagerie par microscopie à force atomique de l'AIT. Pour exprimer le domaine intracellulaire recombinant de l'APP, ou AIT, commencez par des cellules BL21 transformées avec le vecteur pgx41, contenant le domaine intracellulaire humain de l'APP fusionné au niveau du terminus C du GST. Inoculez 10 millilitres de bouillon LB contenant de l'ampicilline avec une colonie unique et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius sous agitation vigoureuse. Le lendemain matin,

Incuber 400 millilitres de LB ampicilline dans un flacon d'un litre avec cinq millilitres de la culture de nuit. Incuber à 37 degrés Celsius avec agitation vigoureuse jusqu'à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne entre 0,4 et 0,6. Cela prendra normalement de deux à 2,5 heures pour induire l'expression de G-S-T-A-I-C-D.

Nous ajoutons 0,4 millimolaire d'IPTG et incubons à 37 degrés Celsius avec agitation vigoureuse pendant cinq heures. Centrifuger les cellules à 6 000 ×g pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius et conserver le culot à –80 degrés Celsius. Après avoir préparé le tampon de lyse et placé les bactéries sur de la glace, ajouter 20 millilitres de tampon au culot et mélanger soigneusement à l’aide d’une combinaison de vortexage et de pipetage sur glace.

Resuspendre le culot bactérien dans le Reese, puis faire passer le lysat bactérien resuspendu dans un émulsifieur refroidi ou un pressoir français. À 30 000 PSI, faire passer le lysat à travers l'émulsifieur une deuxième fois et recueillir le lysat dans un tube de 50 millilitres prérefroidi. Centrifuger le lysat à 15 000 ×g et à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Séparez et transférez le surnageant dans un tube de 50 millilitres prérefroidi. Ajoutez 500 microlitres d'une suspension à 50 % de glutathion liée à l'agarose. Incubez en rotation pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, en maintenant la rotation de l'échantillon.

Préparez un tampon d'élution frais après l'incubation. Versez le lysat et la suspension dans une colonne de chromatographie jetable en polystyrène de cinq pouces munie de filtres grossiers. Lavez la colonne cinq fois avec trois millilitres de PBS.

Fermez l'extrémité inférieure de la colonne et ajoutez 500 microlitres de tampon d'élution à température ambiante. Fermez l'extrémité supérieure de la colonne et faites-la tourner pendant cinq minutes à température ambiante. Récupérez l'élution précoce dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre refroidi.

Répétez l'élution deux fois supplémentaires. Dialysez l'éluat dans une membrane de dialyse ayant une coupure de poids moléculaire de 10 000 dans quatre litres de PBS pendant la nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant. Effectuez une dialyse contre quatre litres supplémentaires de PBS à quatre degrés Celsius pendant une heure.

Retirer la protéine de la cassette de dialyse et effectuer un dosage de quantification protéique afin de déterminer le rendement de G-S-T-A-I-C-D. Une purification typique à partir de 400 millilitres de culture permet d'obtenir un rendement supérieur à 20 milligrammes de protéine purifiée, à des concentrations de 10 à 20 milligrammes par millilitre. Répartir la protéine en aliquots de 200 microlitres et congeler à moins 80 degrés Celsius.

Pour libérer l'ICD de A du GST après décongélation, ajouter 200 microlitres de GST-A-ICD purifié et 20 microlitres de thrombine à une unité par microlitre, puis incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le jour suivant, éliminer tout matériau agrégé par centrifugation à 20 000 ×g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. Transférer le surnageant dans un microtube prérefroidi afin de retirer le GST et la thrombine. Ajouter respectivement 50 microlitres de suspension à 50 % de glutathion et 50 microlitres de suspension à 50 % de Prowinozaine.

Incuber avec rotation pendant cinq minutes à température ambiante. Faire une courte centrifugation pour faire sédimenter les billes agro et retirer le surnageant dans un tube propre. Extraire la GST quatre fois supplémentaires avec du glutathion.

Aros réalise un dosage de la quantité de protéine sur cinq microlitres de l'AIT purifié. Les rendements typiques obtenus à partir d'une culture de 400 millilitres sont de 50 à 100 microgrammes à une concentration de 0,2 à 0,5 milligramme par millilitre. Après avoir dilué l'AIT fraîchement préparé dans du PBS jusqu'à une concentration de 0,1 milligramme par millilitre, on induit l'agrégation thermique en incubant les échantillons à 43 degrés Celsius à 800 tr/min dans un agitateur chauffant pendant 48 heures.

Diluez l'échantillon 20 fois avec de l'eau déionisée et déposez deux microlitres sur du mica fraîchement clivé. Sèchez l'échantillon dans un dessiccateur pendant toute une nuit pour visualiser les agrégats d'ACID en microscopie à force atomique en mode tapping, à l'aide de cantilevers en nitrure de silicium MicroTIPS or dorés avec un rayon de pointe nominal de deux nanomètres.

Amplitudes typiques de balayage pendant l'imagerie, de 10 à 20 nanomètres à la fréquence de résonance des leviers. L'expression et l'enrichissement relatif de G-S-T-A-I-C-D sont présentés ici. Après lyse, la majeure partie de la protéine de fusion se trouve dans la fraction soluble, et une extraction à partir des corps d'inclusion n'est donc pas nécessaire.

Le matériel élué à partir de la colonne de glutathion est pur à plus de 95 %. Dans la préparation présentée ici, la concentration des protéines éluées de la colonne était de 14,5 milligrammes par millilitre, et le rendement était de 22 milligrammes. Le clivage de 200 microlitres de cette préparation pendant la nuit avec 20 unités de thrombine a entraîné un clivage quasi complet (près de 100 %) de la protéine de fusion.

La quantité de thrombine utilisée est suffisamment faible pour ne pas être détectable par kumasi. La coloration bleue et l'élimination de la thrombine et de la GST ont entraîné une certaine perte de matériau. Toutefois, la préparation était pure à plus de 90 %, avec un rendement de 70 microgrammes d'AILC à une concentration de 0,35 milligramme par millilitre dans cette préparation.

Les agrégats d'ICD, observés par microscopie à fluorescence (FM), sont généralement amorphes et stéroïdiens, et varient en taille entre 50 et 100 nanomètres. Le matériau agrégé n'est pas détectable lorsqu'une quantité équimolaire de la chaperonne UBI Quillin un est ajoutée à la réaction d'agrégation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment purifier l'EICD, induire son agrégation et visualiser les agrégats par A-F-M-E-I-C-D.

Purifié par cette technique, il peut être appliqué à d'autres méthodes telles que la diffusion de la lumière et les tests de piégeage sur filtre afin d'aborder des questions relatives à l'effet des chaperonnes moléculaires sur l'agrégation des EACD.