Différencier les rôles fonctionnels de l'expression des gènes de cellules immunitaires et non immunitaires dans l'intestin de souris par greffe de moelle osseuse

L'objectif général de l'expérience illustrée dans cette vidéo est d'évaluer si le peptide antimicrobien lyin joue un rôle dans l'amélioration de la colite induite par le dextran sulfate chez la souris. Cela est réalisé en injectant de la moelle osseuse provenant de souris de type sauvage dans des souris licit et des souris invalidées irradiées, ainsi que de la moelle osseuse provenant de souris invalidées dans des souris de type sauvage irradiées. La moelle osseuse transplantée générera de nouvelles cellules sanguines chez le receveur, de génotype donneur.

Les souris réceptrices sont ensuite exposées au sulfate de dextran afin d'induire une colite après quatre semaines. La transplantation réussie est validée par cytométrie en flux et les lésions tissulaires coliques sont évaluées par histologie. Les résultats obtenus montrent que la colite est atténuée lorsque de la moelle osseuse de type sauvage est transplantée chez des souris knock-out.

En revanche, la colite s'aggrave lorsque de la moelle osseuse de souris invalidée est transplantée dans des souris de type sauvage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la détermination des expressions géniques provenant de cellules d'origine médullaire ou de cellules non d'origine médullaire lors d'une inflammation ou d'une infection. Des souris C57, noires six, de type sauvage et des souris invalidées C elicited sont recommandées pour cette expérience afin de permettre le traçage des souris de type sauvage et des souris invalidées.

Cellules donneuses après la greffe de moelle osseuse. Utilisez des souris CD 45.1 pour représenter les souris de type sauvage et des souris CD 45.2 pour les souris invalidées. Le graphique présenté ici décrit le dispositif expérimental : cinq souris donneuses et dix souris receveuses sont attribuées à chaque groupe.

Pour les groupes A et B, la moelle osseuse sera transplantée de souris de type sauvage à des souris invalidées. Une colite sera induite dans le groupe A, mais pas dans le groupe B. Pour les groupes C et D, la moelle osseuse sera transplantée de souris invalidées à des souris de type sauvage, et la colite sera induite uniquement dans le groupe C. Pour les groupes E et F, le transplant sera effectué de souris de type sauvage à des souris de type sauvage, et pour les groupes G et H, le transplant sera effectué de souris invalidées à des souris invalidées. Pour préparer la moelle osseuse donneur en vue de son transfert vers des souris irradiées, commencez par extraire la moelle osseuse des os de souris sacrifiées dans une cabine de sécurité biologique.

Utilisez des instruments de dissection stériles pour exposer les os du humérus, du fémur, du tibia et de la fibula en les libérant des muscles et des ligaments auxquels ils sont attachés, puis transférez-les dans une boîte de Pétri. Coupez les deux extrémités des os afin de faire apparaître la moelle osseuse rouge. Ensuite, saisissez un des os avec une pince.

Éliminer la moelle osseuse rouge à l’aide de PBS froid, à l’aide d’une seringue de trois millilitres et d’aiguilles de calibre 25, vers une autre boîte de Pétri. Ensuite, rincer l’os par l’autre extrémité afin d’obtenir davantage de cellules de la moelle osseuse. Répéter ce processus pour chacun des os.

Regroupez séparément la moelle osseuse de souris de type sauvage et de souris invalidées. Utilisez une seringue de six millilitres munie d'une aiguille de 18 gauge d'un demi-pouce pour fragmenter les bouchons de moelle osseuse rouge par aspirations et expulsions répétées. Ensuite, utilisez une pipette sérologique pour transférer la moelle osseuse recueillie dans un tube conique de 50 millilitres.

Une fois que toute la moelle osseuse a été transférée, centrifuger la moelle osseuse à 740 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot en vortexant pendant cinq à dix secondes. Au culot, ajouter cinq millilitres de tampon de lyse de globules rouges 1x par souris donneur, vortexer à nouveau pendant cinq secondes, puis incuber exactement trois minutes à température ambiante.

Après trois minutes, ajouter 20 millilitres de PBS froid dans chaque tube et mélanger par retournement pour arrêter la lyse. Ensuite, verser le contenu à travers un tamis cellulaire de 40 microns dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Rincer le tube d'origine avec cinq millilitres de PBS et transférer la solution vers le tamis cellulaire.

Continuer à recueillir l'écoulement dans le tube conique. Ensuite, amener le volume à 50 millilitres avec du PBS et mélanger par retournement. Puis, déterminer le nombre de cellules viables par exclusion au bleu de trypan en utilisant un hémocytomètre.

Une fois le nombre de cellules déterminé, centrifuger les cellules de la moelle osseuse à 913 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, éliminer le surnageant en fonction du nombre total de cellules. Resuspendre le culot dans du PBS à une concentration de 1 × 10⁸ cellules par millilitre.

Les cellules de la moelle osseuse sont désormais prêtes à être transférées dans des souris réceptrices irradiées. Les souris réceptrices de type sauvage et les souris invalidées pour cette expérience ont été irradiées avec 1000 rad comme décrit dans le document accompagnant, les souris sont élevées et maintenues dans une installation exempte de pathogènes ; quatre à vingt-quatre heures après l'irradiation, réchauffez les souris réceptrices sur un tapis chauffant sous une lampe chauffante afin d'injecter la moelle osseuse du donneur. Placez une souris réceptrice dans un dispositif de contention, essuyez la queue avec de l'éthanol à 70 % pour stériliser le site d'injection et favoriser une vasodilatation locale facilitant l'injection.

À l’aide d’une seringue à insuline munie d’une aiguille de calibre 28 et demi, injecter une fois dix puissance sept cellules dans un volume de 1 à 200 microlitres dans la veine de la queue de chaque souris après l’injection. Placer la souris dans une cage avec jusqu’à trois autres souris injectées pendant les quatre premières semaines suivant l’injection. Maintenir les souris réceptrices injectées dans des cages autoclavées avec de l’eau contenant l’antibiotique sulfa trim.

Cela permet de laisser suffisamment de temps aux animaux pour retrouver leur immunité, changer les cages ainsi que l’eau et la nourriture traitées aux antibiotiques tous les quatre jours afin de maintenir l’hygiène. Quatre semaines après l’irradiation et la greffe de moelle osseuse, passer à de l’eau ordinaire sans antibiotiques et maintenir les souris pendant deux semaines supplémentaires afin qu’elles retrouvent leur microflore intestinale normale. Six semaines après l’injection de moelle osseuse, mesurer le poids corporel initial pour induire une colite.

Donnez aux souris du groupe expérimental de colite 5 % de dextran sulfate dans l’eau de boisson. Cinq jours plus tard, réunissez le sang périphérique provenant de quatre souris dans des tubes Vacutainer recouverts d’héparine et placez-les sur de la glace. Ensuite, dans un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre, mélangez 300 microlitres de sang avec 300 microlitres de tampon de marquage cellulaire, puis répartissez le sang dans cinq tubes de cytométrie en flux numérotés de un à cinq, chacun contenant 100 microlitres, en les maintenant sur de la glace.

Après avoir sacrifié les souris, mesurez à nouveau le poids corporel et calculez la variation. Disséquez les tissus du côlon et placez-les en formol pour la coloration h et d. Ensuite, récupérez les cellules de la moelle osseuse comme précédemment.

Diviser la moelle osseuse resuspendue en cinq tubes de microcentrifugeuse étiquetés de un à cinq, chacun contenant 100 millilitres. En prévision de l'analyse par cytométrie en flux, préparer le mélange d'anticorps pour chaque tube respectif dans l'obscurité, comme décrit dans le document accompagnant. Les échantillons de sang et de moelle osseuse étiquetés numéro un serviront de témoins et ne seront pas soumis à la coloration. Les échantillons de sang et de moelle osseuse étiquetés numéro deux seront colorés avec le contrôle d'isotype FITC, le contrôle d'isotype PE et la solution de blocage CD16/32.

Ces témoins d'isotype sont utilisés pour confirmer la spécificité de la liaison de l'anticorps primaire aux échantillons. L'échantillon numéroté trois sera marqué avec FZ CD 45,1 et CD 16/32. Les échantillons traités avec la solution de blocage, numérotés quatre, seront marqués avec CD 45,2 et CD 16/32.

Solution de blocage. Un marquage en une seule couleur peut révéler la présence de cellules donneuses ou receveuses dans le sang ou la moelle osseuse. Il est clair que les échantillons numérotés cinq seront colorés pour CD 45.1, CD 45.2 et CD 16/32.

Le blocage ici, l'étiquetage en double couleur montre le rapport relatif des cellules donneuses et receveuses dans le sang ou la moelle osseuse. Ajoutez cinq microlitres du mélange d'anticorps deux et cinq à leurs tubes d'échantillon respectifs. Ensuite, ajoutez trois microlitres du mélange d'anticorps trois et quatre à leurs tubes d'échantillon respectifs.

Incuber tous les tubes sur de la glace pendant 30 minutes. Après l'incubation, ajouter deux millilitres de tampon de lyse XRBC à chaque tube. Puis incuber les échantillons pendant encore 15 minutes sur de la glace, à l'abri de la lumière.

Faire centrifuger les cellules à 350 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, retirer le surnageant et resuspendre le culot avec 500 microlitres de tampon de marquage cellulaire à l’abri de la lumière. Ensuite, vortexer brièvement.

Ensuite, réalisez une cytométrie en flux sur les échantillons de sang et de moelle osseuse immunomarqués. Sélectionnez FZ pour représenter le type sauvage CD 45.1 et PE pour représenter l'isoforme nulle CD 45.2. Analysez les résultats de cytométrie en flux à l'aide du logiciel de Flo Joe.

Calculez le rapport de l'ajustement E au rapport PE, ou du rapport PE à l'ajustement e, afin de déterminer si le génotype du donneur est un génotype dominant dans le sang et la moelle osseuse. Cette image montre des exemples d'images hématoxyline-éosine de colon ayant une histologie normale et une colite DSS. Les images d'histologie sont notées en fonction des lésions tissulaires de la muqueuse et de l'infiltration de neutrophiles dans les tissus muqueux et sous-muqueux.

Ainsi, un score d'histologie plus élevé indique une colite plus sévère, afin de tester si lyin joue un rôle dans la prévention de la colite. La moelle osseuse a été échangée entre des souris de type sauvage et des souris invalidées selon la méthode décrite dans cette vidéo. L'histologie a ensuite été évaluée et notée comme illustré ici.

Les scores d'histologie ont augmenté de manière significative lorsque de la moelle osseuse provenant de souris knock-out a été introduite dans des souris de type sauvage irradiées. Inversement, les scores ont diminué de manière significative lorsque de la moelle osseuse de type sauvage a été introduite dans des souris knock-out. Ces données indiquent que la protéine C endogène provenant de cellules dérivées de la moelle osseuse exerce des effets anti-inflammatoires et atténue la colite, ce qui permet de confirmer que la greffe a été couronnée de succès chez ces souris.

La cytométrie en flux a également été réalisée sur la moelle osseuse et le sang des souris après la transplantation. La moelle osseuse de type sauvage se colore fortement pour Fitz CD 45.1, mais pas pour pe, CD 45.2 comme indiqué ici ; la moelle osseuse de type knock-out se colore fortement pour PE, mais pas pour Fitz, comme indiqué ici. Toutefois, après la transplantation, la moelle osseuse et le sang des souris de type sauvage ayant reçu la moelle osseuse de type knock-out se sont fortement colorés pour PE, mais pas pour Fitz, indiquant que la population majoritaire de cellules colorées provenait du donneur.

De même, la moelle osseuse et le sang de souris invalidées ayant reçu une moelle osseuse de type sauvage se sont fortement colorés pour fitzy, mais pas pour pe, confirmant ainsi que les populations colorées prédominantes étaient d'origine donneur. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de réaliser une expérience de transplantation de moelle osseuse et de modifier la colite à l'aide de cellules dérivées de la moelle osseuse.