Combler l'interface bio-électronique avec Biofabrication

L'objectif général de l'expérience suivante est de déposer électriquement des films biopolymériques et de les fonctionnaliser avec des composants biologiques tels que des protéines et des cellules. Le dépôt électrochimique s'obtient en exploitant la variation de pH qui se produit localement au niveau d'une électrode polarisée, en combinaison avec une solution de polysaccharide sensible au pH. Après avoir choisi une stratégie de dépôt cathodique ou anodique, l'électrode est polarisée afin d'induire une transition sol-gel, générant ainsi un film mince dont le motif est défini par la géométrie de l'électrode.

En outre, des composants biologiques tels que des protéines et des cellules peuvent être introduits tout au long du processus de dépôt des électrodes. Afin de fonctionnaliser biologiquement le film, des résultats sont obtenus qui montrent que les composants biologiques sont localisés dans les films, comme le révèlent des images de fluorescence. De plus, ces composants sont fonctionnels et capables d'interagir avec leur environnement, comme le démontre la détection électrochimique de l'activité enzymatique et l'utilisation de la réponse de cellules rapporteuses.

La biofabrication offre une boîte à outils innovante pour construire l'interface entre la biologie et l'électronique. Nous pensons que ses principaux avantages résident dans sa simplicité et sa capacité à s'assembler dans des conditions proches des conditions physiologiques. La biologie maîtrise la fabrication à l'échelle nanométrique grâce à l'auto-assemblage et à des moyens enzymatiques. En exploitant ces capacités, nous contournons des méthodes de synthèse complexes, dangereuses et longues utilisées par d'autres techniques d'assemblage.

Notre équipe collaborative a eu l'idée de concevoir une interface de dispositif BioD en utilisant des matériaux et des mécanismes biologiques lorsque nous avons observé que leurs cerfs-volants pouvaient être déposés par électrode. Le kitan est un polysaccharide formant un film sensible au pH, capable de reconnaître les signaux électriques imposés par un dispositif et de se déposer sous forme de film mince. Dès que nous avons constaté que le kitan pouvait être déposé par électrode, nous avons compris que nous pouvions accéder à un ensemble plus vaste d'outils issus de la biochimie et de la biologie moléculaire pour construire une interface de dispositif BioD.

L'application d'une telle technique s'étend aux dispositifs de type laboratoire-sur-puce où des composants biologiques fonctionnels sont nécessaires, car ils offrent un moyen économique et simple de localiser ces composants sur une électrode, où ils peuvent rester viables. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car un film biofabriqué peut être délicat et facilement endommagé. Il convient donc d'être prudent afin de ne pas être trop vigoureux lors du lavage ou de la manipulation du film.

Étant donné que le film pourrait être facilement perturbé. Toutefois, un avantage est que les électrodes peuvent être réutilisées, car le film est facilement retiré. Pour commencer ce protocole, reliez une alimentation électrique aux électrodes fabriquées sur mesure à l’aide de câbles de raccordement munis de pinces crocodile.

Une lame de verre recouverte d'oxyde d'indium-étain, ou ITO, servira d'anode ou d'électrode de travail, tandis qu'une feuille de platine fera office de cathode ou d'électrode auxiliaire. Positionnez les électrodes de sorte que la surface de l'ITO destinée à être fonctionnalisée soit opposée à l'électrode auxiliaire, soit verticalement pour être plongée dans la solution, soit horizontalement, afin que la solution puisse être contenue à la surface. Ensuite, préparez une solution de dépôt d'alginate en mélangeant 1 % d'alginate et 0,5 % de carbonate de calcium dans de l'eau distillée, puis stérilisez le mélange à l'autoclave. Puis, marquez l'alginate de manière fluorescente à l'aide de Fluor Spheres en mélangeant et en vortexant.

Ceci permettra l'imagerie par fluorescence du film obtenu. Après stérilisation à l'autoclave, plonger les deux électrodes dans la solution de dépôt préparée et appliquer une densité de courant constante de trois ampères par mètre carré pendant deux minutes. La tension variera entre deux et trois volts. Au bout de deux minutes, déconnecter l'électrode et éliminer la solution contenant les dépôts non adhérents. Rincer délicatement le film avec du chlorure de sodium pour éliminer l'alginate en excès.

Incuber brièvement le film dans du chlorure de calcium 0,1 M pour renforcer le gel. Ensuite, incuber le film dans la solution de stockage souhaitée. Procéder à l'imagerie du film par microscopie de fluorescence avant la co-dépôt.

Faites croître une culture cellulaire donneuse de signal et une culture cellulaire receveuse de signal conformément au protocole écrit accompagnant cette vidéo. Préparez ensuite une solution de dépôt d'alginate et de carbonate de calcium. Mélangez la solution avec chaque culture cellulaire selon un rapport de un pour un, afin d'obtenir une concentration finale de 1 % d'alginate et de 0,5 % de carbonate de calcium, les cellules étant diluées à environ la moitié de leur densité de culture.

Utilisez une lame de verre comportant deux électrodes en oxyde d'indium-étain (ITO) délimitées par un puits en silane de polydiméthyle et une électrode contre en platine. Connectez une électrode ITO et l'électrode en platine à une alimentation électrique. Comme précédemment, immergez les électrodes dans la solution de dépôt contenant les cellules réceptrices.

Régler l'alimentation électrique sur un courant constant à une densité de trois ampères par mètre carré, où la dimension de la surface est définie par l'électrode unique sur laquelle se produira le dépôt. Appliquer le courant pendant deux minutes afin de permettre la codéposition des cellules dans la matrice d'alginate. Rincer le film avec du chlorure de sodium comme précédemment, puis inverser la connexion antic sur l'électrode ITO adjacente.

Répétez la procédure de dépôt, mais cette fois, introduisez la solution contenant les cellules donneuses. Incubez la puce à deux électrodes contenant les cellules co-déposées et l'arginate de calcium pendant toute la nuit à 37 degrés Celsius dans du chlorure de sodium tamponné au phosphate.

Supplémenté avec un milieu LB à 10 % et un millimolaire de chlorure de calcium. Après incubation, imagez la puce à l’aide d’un microscope à fluorescence pour commencer le dépôt de l’électrode de chitosane. Connectez l’alimentation électrique aux électrodes.

Enflammer les pinces crocodile. Une puce de silicium revêtue d'or servira de cathode et une feuille de platine servira d'anode. Positionner la surface de l'électrode d'or de manière à ce qu'elle dépose l'électrode opposée comme précédemment.

Préparez une solution de sable Kato en mélangeant des flocons de sable Kato dans de l'eau et en ajoutant lentement de l'acide chlorhydrique deux molaire pour dissoudre les polysaccharides. En suivant la procédure mentionnée dans le texte, la solution de sable Kato peut être marquée de manière fluorescente afin d'observer par microscopie à fluorescence le film déposé sur l'électrode. Ensuite, placez les électrodes dans la solution kaizan en immergeant complètement la zone destinée au dépôt.

Pendant deux minutes, appliquez un courant constant calculé à une densité de quatre ampères par mètre carré, en fonction de la surface de l'électrode de travail. Dans ce cas, un courant de 16 microampères est appliqué à une électrode d'or de quatre millimètres carrés ; la tension décalera dans une plage de deux à trois volts après rinçage de l'électrode avec de l'eau déionisée afin d'éliminer l'excès de chitosane. Passez ensuite à l'imagerie du film à l'aide d'un microscope à fluorescence, en déposant conjointement chitosane et glucose oxydase à partir d'une solution à une densité de courant de quatre ampères par mètre carré sur une électrode structurée.

Suivant la procédure de dépôt d'électrode en chitosane, un film de kaizan piégeant la glucose oxydase sera généré. Fixer l'électrode traitée à un système à trois électrodes en tant qu'électrode de travail, un fil de platine en tant qu'électrode auxiliaire et un argent/argent chlorure en tant qu'électrode de référence, puis plonger les électrodes dans une solution tampon phosphate contenant du chlorure de sodium. Conjuguer électrochimiquement la protéine au film Kazam en appliquant une tension constante pendant 60 secondes à l'aide de la chronoampérométrie après la conjugaison.

Placer la puce dans un tampon phosphate et laver pendant 10 minutes sur un agitateur orbital afin d'éliminer tout chlorure de sodium non réactif et toute glucose oxydase non conjuguée. Réinstaller le système à trois électrodes et plonger dans une solution de glucose à cinq millimolaire. Ensuite, régler les paramètres souhaités pour la voltammétrie cyclique afin de balayer le potentiel dans le sens positif jusqu'à 0,7 volt.

Retirez les électrodes de la solution de glucose et rincez-les avec du tampon phosphate. Ensuite, placez les électrodes dans un bécher de 10 millilitres contenant huit millilitres de tampon phosphate sur une plaque d'agitation magnétique biaisée. Appliquez une tension de 0,6 volt sur la puce fonctionnalisée GOX pour qu'elle serve d'électrode de travail.

Après avoir réglé les paramètres souhaités, enregistrez un signal de référence. Ajoutez des aliquotes de glucose au tampon afin d'augmenter la concentration en glucose de quatre millimolaire par aliquote. Dans cette expérience, des aliquotes de 400 microlitres de glucose à 80 millimolaire sont ajoutées au tampon. Corréléz le signal électrique à chaque concentration de glucose afin d'élaborer une courbe standard. Pour réaliser la fonctionnalisation des protéines, utilisez une lame de verre comportant une électrode en or et une électrode ITO adjacentes, contenues dans A-P-D-M-S.

Appliquez une polarisation à l'électrode en or avec un potentiel cathodique afin de déposer électrochimiquement le tizen, comme indiqué précédemment. Après avoir rincé le film, ajoutez une solution de synthase de l'auto-inducteur deux marquée par un fluorophore bleu, complétée par de la tyrosinase. Incubez pendant une heure à température ambiante.

Rincez le film avec du PBS comme précédemment, appliquez un potentiel anodique à l'électrode ITO immergée dans une solution de dépôt d'alginate contenant les cellules réceptrices. Poursuivez avec les mêmes étapes décrites dans le codepôt de populations cellulaires dans l'alginate afin de générer le signal transmis de manière enzymatique. Après avoir rincé les films, ajoutez une solution de cinq micromolaire, SAH et PBS supplémentée avec 10 % de milieu LB et un millimolaire.

Le chlorure de calcium recouvre les électrodes afin d'éviter l'évaporation de la solution et est incubé toute la nuit à 37 degrés Celsius. Cela permettra une réponse des cellules réceptrices en générant une protéine fluorescente rouge DS red. Des électrodes adjacentes peuvent être observées en microscopie à fluorescence en ajustant les filtres pour capter la fluorescence bleue du synthonase inducteur ainsi que la fluorescence rouge exprimée par les cellules réceptrices réquisitionnées. Des signaux électriques imposés peuvent créer des microenvironnements localisés près de la surface d'une électrode, et ces stimuli peuvent déclencher l'auto-assemblage de polysaccharides tels que l'alginate et le razan, qui se déposent sous forme de film hydrogel sur la surface de l'électrode.

Étant donné que cette transition sol-gel se produit à la surface de l'électrode, le film résultant est électrolocalisé avec une géométrie correspondant au motif de l'électrode. En utilisant l'alginate, des populations cellulaires distinctes ont été co-déposées à des adresses séparées. La preuve de leur adressage électrode est observée lors de l'interaction entre la population cellulaire émettrice et la population cellulaire réceptrice.

La molécule auto-inductrice deux diffuse à partir des cellules émettrices et est captée par les cellules réceptrices, entraînant l'expression de la protéine fluorescente DS rouge. Ici, une fluorescence rouge est observée uniquement à l'électrode où les cellules réceptrices sont localisées. Inversement, l'enzyme biosensible, la glucose oxydase, permet la détection du glucose par une réaction enzymatique produisant du peroxyde d'hydrogène, qui peut ensuite être oxydé électrochimiquement pour générer un courant de sortie.

Ainsi, un signal chimique peut être transduit en un signal électrique. Ce graphique montre que les films dans lesquels Geo X a été chimiquement conjugué produisent un signal antic fort en présence de glucose, contrairement aux films ne contenant pas Geo X. Ces résultats indiquent que Geo X peut être assemblé sur un film zam déposé et peut conserver son activité catalytique. En outre, une augmentation par paliers du courant otique est produite en réponse à une concentration croissante de glucose.

La courbe standard présentée montre également que les augmentations progressives ont suivi une évolution quasi linéaire en fonction de la quantité de glucose ajoutée. Ces résultats indiquent que l'enzyme conserve également sa sensibilité après conjugaison au film Razza. Comme illustré ici, la I deux synthase comprend une étiquette Penta tyrosine. La tyrosinase agit sur l'étiquette tyrosine en oxydant les groupes phénol des résidus en o-quinones, qui se lient ensuite de manière covalente aux amines de Kazam. Des preuves de la fonctionnalisation du film Kazam par l'assemblage de la I deux synthase via la tyrosinase sont observées sur cette image de fluorescence, montrant un film kaza sur or, où la I deux synthase fonctionnalisée a été marquée en bleu par fluorescence. Étant donné qu'une I deux synthase produit de l'I deux à partir du substrat SAH de la même manière que les cellules émettrices, sa proximité avec les cellules réceptrices recrutées en présence de SAH provoque également une réponse fluorescente de ces dernières, caractérisée par l'expression de ds.

La fluorescence rouge des cellules réceptrices démontre à nouveau l'interaction entre les adresses en raison de la diffusion de l'AI-2 de l'une à l'autre, et indique en outre que les 10 enzymes immobilisées sur le tizène conservent leur activité une fois liées de manière covalente. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de déposer électriquement des films de polysaccharides et de les fonctionnaliser à l’aide de diverses techniques. Nous avons démontré la polyvalence de ces étapes de fonctionnalisation, ce qui nous permet de travailler avec une multitude de composants biologiques lors de tests ultérieurs.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en aussi peu que quelques minutes afin de produire des motifs de film bien définis sur lesquels des composants biologiques peuvent être greffés avec précision. Ainsi, nous sommes en mesure de générer très facilement des surfaces biologiquement structurées et actives sur des électrodes désignées, le tout réalisé de manière organisée tout en permettant d'obtenir des interactions biologiques complexes. Après cette procédure, la créativité peut être exploitée à la fois dans la conception du réseau électrochimique et dans le choix des composants biologiques afin d'atteindre l'interaction souhaitée.

Notre espoir est que les outils de biofabrication permettront de rapprocher deux domaines très différents, la biotechnologie et la microélectronique, chacun ayant révolutionné notre vie de manière individuelle. En associant ces deux domaines, nous pensons pouvoir créer de nouvelles solutions à certains des problèmes les plus urgents de la société. Par exemple, nous imaginons que la biofabrication pourrait offrir des méthodes simples et polyvalentes pour de nouveaux modes de détection, destinés aux soins de proximité, au diagnostic des maladies ainsi qu’à la détection de menaces biologiques et chimiques.

Un exemple à portée étendue pourrait être qu'un stent artériel de prochaine génération serait également capable de surveiller votre profil métabolique tout en maintenant votre artère ouverte.