Compact points quantiques pour une seule molécule d'imagerie

L'objectif général de cette procédure est de préparer des points quantiques fluorescents présentant une luminosité et une stabilité optimisées, ainsi qu'une taille réduite et une liaison non spécifique minimisée, destinés à l'imagerie de molécules uniques. Cela est réalisé en préparant tout d'abord de petits cœurs de points quantiques de séléniure de cadmium. La deuxième étape consiste à allier ces cœurs au mercure afin de décaler leur fluorescence vers le spectre rouge et d'augmenter leur luminosité.

Ensuite, une fine couche d'alliage est déposée sur les nanocristaux afin de stabiliser leur émission de fluorescence. La dernière étape consiste à transférer ces particules depuis des solvants organiques vers des tampons aqueux à l'aide d'un polymère multidenté, pouvant être modifié par du polyéthylène glycol biologiquement inerte. Enfin, la spectrométrie de fluorescence, la chromatographie sur gel et l'électrophorèse sur gel sont utilisées pour démontrer que ces particules présentent une fluorescence intense, une taille hydrodynamique compacte et une charge électrostatique neutre, des caractéristiques particulièrement adaptées à l'imagerie de fluorescence à l'échelle de la molécule unique en biologie.

L'avantage principal de ces points quantiques par rapport aux matériaux commerciaux existants réside dans leur taille hydrodynamique significativement réduite. Bien que les points quantiques plus petits subissent une diminution de l'intensité de fluorescence, une moindre stabilité de la fluorescence et une émission limitée au spectre bleu, nous avons compensé ces effets grâce à un processus d'échange de cations de mercure. Ces nano-cristaux peuvent contribuer à répondre à des questions fondamentales en biophysique et en signalisation cellulaire en permettant l'imagerie dynamique de biomolécules uniques dans des environnements biologiques denses.

Pour commencer, préparez une solution 0,4 molaire de sélénium dans le T.O.P. en ajoutant du sélénium à un ballon tricol de 50 millilitres. Évacuez le ballon sous vide poussé, puis remplissez-le d'argon à l'aide d'une ligne Schlenk en conditions sans air. Ajoutez 10 millilitres de T.O.P. et chauffez à 100 degrés Celsius sous agitation pendant une heure afin d'obtenir une solution limpide et incolore.

Refroidir la solution à température ambiante et mettre le ballon de côté. Préparer également une solution d'oxyde de cadmium, de TDPA et d'ODE dans un ballon à trois cols de 250 millilitres en utilisant les quantités indiquées dans le protocole écrit. En parallèle à cette vidéo, évacuer la solution à l'aide d'une ligne de vide tout en agitant.

Augmentez la température à 100 degrés Celsius et faites le vide pendant 15 minutes supplémentaires. Pour éliminer les impuretés à bas point d'ébullition sous gaz argon, chauffez le mélange à 300 degrés Celsius pendant une heure afin de dissoudre complètement l'oxyde de cadmium. La solution passera d'une couleur rougeâtre à une solution claire et incolore ; laissez refroidir la solution à température ambiante.

Ensuite, ajoutez du HDA à la solution de cadmium, chauffez à 70 degrés Celsius et faites le vide. Une fois la pression constante atteinte, augmentez la température et faites réagir la solution par reflux pendant 30 minutes. Passez la vanne de la ligne Schlenk au gaz inerte et insérez le thermocouple directement dans la solution.

Dans des conditions sans air, ajoutez le DPP à la solution de cadmium et augmentez la température jusqu'à 310 degrés Celsius. Utilisez maintenant une seringue en plastique jetable munie d'une aiguille de calibre 16 pour prélever 7,5 millilitres de la solution supérieure de sélénium à 0,4 molaire. Une fois la température stabilisée à 310 degrés Celsius, réglez le contrôleur de température à zéro degré Celsius et injectez rapidement la solution supérieure de sélénium directement dans la solution de cadmium.

La solution passera de incolore à jaune, puis à orange, et la température diminuera rapidement avant d'augmenter à nouveau jusqu'à environ 280 degrés Celsius. L'étape la plus délicate de cette procédure consiste à injecter le volume total de la seringue le plus rapidement possible dans la solution de cadmium. Cela garantit une nucléation homogène des particules.

Après une minute de réaction, retirez le ballon du manteau chauffant et refroidissez rapidement à l’aide d’un courant d’air jusqu’à ce que la température soit inférieure à 200 degrés Celsius. Lorsque la température atteint environ 40 degrés Celsius, diluez avec 30 millilitres d’hexane ; la majeure partie du précurseur de cadmium restant se déposera hors solution. Éliminez ce précipité par centrifugation.

Dans chacun des six tubes coniques de centrifugation en polypropylène de 50 millilitres, diluez 12 millilitres de la solution brute de nano Krystal obtenue. Ajoutez 40 millilitres d'acétone, puis, après centrifugation avec les mêmes paramètres, versez soigneusement et jetez le surnageant. Ensuite, dissolvez les pastilles de nano krysttal dans l'hexane.

Extraire la solution avec un volume égal de méthanol en conservant la phase supérieure. Répéter cette extraction deux fois supplémentaires pour la troisième extraction. Le volume de méthanol peut être ajusté à environ 15 millilitres afin d'obtenir une solution concentrée d'hexane de points quantiques de séléniure de cadmium à environ 200 micromolaire.

Le rendement typique de cette réaction est de trois micromoles de cristaux de séléniure de cadmium avec un diamètre de deux à trois nanomètres. Déterminez le diamètre et la concentration des nano-cristaux en mesurant le spectre d'absorption ultraviolet-visible comme décrit dans la procédure écrite. Les nano-cristaux peuvent être partiellement échangés avec du mercure afin de décaler vers le rouge l'absorption et l'émission de fluorescence. Pour ce faire, dans un flacon en verre de 20 millilitres muni d'un barreau d'agitation, mélangez l'hexane et le chloroforme, puis ajoutez la solution de points quantiques de séléniure de cadmium, l'OLA et le mercure octanoïque. Après purification des nano-cristaux et détermination de leur concentration comme décrit dans la procédure écrite, laissez les nano-cristaux vieillir pendant au moins 24 heures à température ambiante pour favoriser la croissance de la couche externe.

Préparer des solutions précursors à 0,1 molaire dans des ballons à trois cols de 50 millilitres sous vide ; chauffer les solutions des précurseurs de cadmium, de zinc et de soufre à reflux pendant une heure afin d'obtenir des solutions limpides, puis charger avec de l'argon dans un ballon à trois cols. Ajouter le topo ODE et les points quantiques de séléniure de mercure et de cadmium préparés. Évacuer l'hexine à température ambiante à l'aide de la rampe latérale.

Augmentez la température à 100 degrés Celsius et effectuez un reflux pendant 15 minutes. Changez le robinet de ligne pour du gaz Argon et insérez le thermocouple dans la solution de nano-cristal. Après avoir augmenté la température à 120 degrés Celsius, ajoutez 0,5 monocouche ou 140 microlitres de solution précurseur de soufre et laissez la réaction se dérouler pendant 15 minutes.

Augmentez la température à 140 degrés Celsius. Ajoutez 0,5 monocouche ou 140 microlitres de solution précurseur de cadmium et laissez la réaction se dérouler pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d'OLA anhydre à la solution réactionnelle.

Ajouter à 160 degrés Celsius, 0,5 monocouche, soit 220 microlitres de solution précurseur de soufre, suivis d'une quantité équivalente de solution précurseur de zinc à 170 degrés Celsius, avec un intervalle de 15 minutes entre chaque addition. Ensuite, à 180 degrés Celsius, ajouter 0,25 monocouche, soit 150 microlitres de solution précurseur de soufre et de solution précurseur de zinc, à des intervalles de 15 minutes. Refroidir. La solution jusqu'à la température ambiante et un nouveau coefficient d'extinction pour ces particules.

À l'aide d'un spectre UV-visible, en supposant que le nombre de nanocristaux n'ait pas changé, conserver la solution réactionnelle en tant que mélange brut au congélateur. À ce stade, les nanocristaux peuvent être caractérisés par microscopie électronique, spectroscopie d'absorption UV-visible et spectroscopie de fluorescence. Ajouter les points quantiques à cœur-enveloppe purifiés dans un ballon tricol de 50 millilitres et éliminer l'hexine sous vide poussé.

Pour obtenir un film sec, remplissez le flacon d'argon. Ajoutez de la purine anhydre au film de nanoparticules et chauffez la suspension à 80 degrés Celsius pendant une à deux heures. Les nanoparticules se dissoudront complètement.

Ajouter un millilitre de glycérol FIO à la solution et agiter à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Après refroidissement de la solution à température ambiante, ajouter 0,5 millilitre de triéthylamine pour déprotoner le thio-glycérol et agiter pendant 30 minutes. La solution peut devenir trouble après l'ajout de triéthylamine en raison de la faible solubilité des nanocristaux polaires dans ce mélange de solvants.

Transférez la solution de points quantiques dans un tube conique de centrifugeuse de 50 millilitres contenant un mélange de 20 millilitres d’hexane et de 20 millilitres d’acétone, puis mélangez soigneusement. Isolez les nanocristaux précipités par centrifugation, suivi d’un lavage du culot à l’acétone, dissolvez le culot de points quantiques dans cinq millilitres de DMSO par sonication au bain et procédez à une nouvelle centrifugation. Pour éliminer les agrégats éventuels, déterminez ensuite la concentration des nanoparticules à partir d’un spectre d’absorption UV-VIS.

La solution de points quantiques purs doit être utilisée dans les trois heures, car leurs surfaces peuvent s'oxyder lentement dans l'air en conditions ambiantes. Diluez la solution de points quantiques à 10 micromolaire ou moins avec du DMSO et transférez-la dans un flacon de 50 millilitres. Ajoutez goutte à goutte, sous agitation, une solution préparée de polyacide polyacrylique dilaté à cinq milligrammes par millilitre dans du DMSO à la solution de points quantiques, puis dégazez la solution à température ambiante pendant cinq minutes.

Purgez la solution polymère de points quantiques avec de l'argon et chauffez à 80 degrés Celsius pendant 90 minutes. Après refroidissement de la solution à température ambiante, ajoutez un volume égal de sodium à 50 millimolaire, pH huit, goutte à goutte, et agitez pendant 10 minutes. Purifiez les points quantiques comme décrit dans la procédure écrite et déterminez la concentration à partir d'un spectre d'absorption UV-visible dans un flacon en verre de quatre millilitres avec barreau d'agitation ; mélangez un micromole de points quantiques dans du tampon borate avec un excès molaire 40 000 fois supérieur de polyéthylène glycol monofonctionnalisé de 750 Dalton.

Des instructions sont disponibles dans le protocole écrit sur la manière d'ajouter une fonctionnalité chimique spécifique aux nanocristaux. Ajoutez rapidement un excès molaire 25 000 fois supérieur d'une solution fraîchement préparée de l'agent activateur à la solution de points quantiques et mélangez à température ambiante pendant 30 minutes. Répétez cette étape quatre fois supplémentaires afin de saturer la surface des nanocristaux avec du PEG.

Enfin, ajoutez 200 microlitres de tampon tris un molaire pour arrêter la réaction avant de purifier les nanocristaux à l’aide de filtres centrifuges de dialyse ou d’ultracentrifugation. Les nanocristaux obtenus peuvent être analysés quant à leur monodispersité, leur taille hydrodynamique et leur charge de surface par chromatographie liquide, électrophorèse sur gel et microscopie à fluorescence. On observe ici des spectres d’absorption et de fluorescence représentatifs de nanocristaux de séléniure de cadmium, de nanocristaux de séléniure de mercure et de cadmium après échange cationique, ainsi que de nanocristaux à cœur de séléniure de mercure et de cadmium et à enveloppe de sulfure de cadmium et de zinc après croissance de l’enveloppe. Les nanocristaux à cœur de séléniure de cadmium présentent un rendement quantique de fluorescence proche de 15 %. Toutefois, cette efficacité chute à moins de 1 % après l’échange de mercure, probablement en raison de pièges pour les porteurs de charge introduits par la perturbation des atomes de surface.

La croissance d'une fine couche de sulfure de cadmium-zinc augmente ce rendement à plus de 70 %, valeur largement maintenue après transfert dans l'eau. En revanche, les nanocristaux à cœur de séléniure de cadmium et à couche de sulfure de cadmium-zinc, sans incorporation de mercure, perdent une fraction importante de leur rendement quantique dans l'eau, à moins qu'une couche épaisse ne soit déposée. Il est important de noter qu'un encapsulation par du sulfure de cadmium-zinc décale les spectres vers le rouge en raison de la fuite des porteurs de charge électroniques dans le matériau de la couche.

Ce décalage est d'environ 20 à 30 nanomètres pour les cœurs à base de cadmium et augmente avec la teneur croissante en mercure dans le cœur. Ainsi, en incorporant du mercure dans le nanocristal de cœur, la petite taille du nano-cristal peut être conservée sans compromettre la luminosité. La petite taille est illustrée par cette micrographie électronique en transmission et la distribution de la taille des particules des nanocristaux de cœur mercure, cadmium, sélénium, et de coquille sulfure de cadmium, zinc, montrant un diamètre moyen de 3,2 ± 0,6 nanomètre.

L'utilisation d'un transfert de phase en deux étapes vers l'eau est essentielle pour obtenir une population homogène de nanocristaux qui ne nécessite pas de tri ultérieur par taille afin d'éliminer les agrégats et les amas par exclusion de taille. Le chromatogramme représenté ici confirme que la taille est similaire à celle de l'albumine de blanc d'œuf. À 75 kilodaltons et après modification par du PEG amino de 750 daltons, la taille augmente jusqu'à atteindre seulement 12 nanomètres, ce qui est comparable à la taille d'un anticorps IgG.

La modification par PEG neutralise la charge de surface, comme confirmé par l'expérience d'électrophorèse sur gel d'aros représentée ici : le puits est marqué par une flèche et les polarités des électrodes sont indiquées à droite, montrant qu'avant la conjugaison, les nanocristaux migrent comme des particules ioniques, tandis que les nanocristaux PEGylés sont électrostatiquement neutres. On voit ici une micrographie en épifluorescence de ces nanocristaux déposés sur un couvre-objet en verre et excités par une lumière visible de 545 nanomètres. Ces nanocristaux sont facilement observables au niveau de la molécule unique à 30 images par seconde à l'aide d'une caméra CCD à multiplication électronique.

Ce graphique montre que le nombre de particules fluorescentes observées dans chaque image varie dans le temps sous excitation continue. Ceci est dû à une combinaison de clignotement et de dégradation photochimique. Le clignotement domine durant les sept premières minutes avant que la dégradation photochimique oxydative ne devienne lentement apparente.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment synthétiser chimiquement des points quantiques, comment les transférer dans des tampons aqueux et comment les modifier pour des applications d'imagerie biologique. N'oubliez pas que le travail avec des réactifs contenant du cadmium et du mercure peut être extrêmement dangereux, et que des précautions supplémentaires doivent être prises pour éviter toute exposition personnelle.