Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l'ADN de réponse

Cette démonstration utilise l'imagerie en cellules vivantes en 2D et 3D pour comprendre les relations spatiotemporelles des protéines impliquées dans la réponse aux dommages de l'ADN. Tout d'abord, transfectez ou transduisez votre lignée cellulaire de choix avec des constructions d'expression contenant des marqueurs fluorescents appropriés. Ici, M Cherry et GFP, puis acquérez une série de vidéos témoins montrant les cellules marquées fluorescentes dans des conditions normales.

Appliquez ensuite un traitement approprié et enregistrez les données des effets du traitement sur le processus des cellules fluorescentes, puis analysez les données vidéo afin d'élucider les relations spatiotemporelles des protéines. En fin de compte, la microscopie en fluorescence sur cellules vivantes permet de détailler la dynamique cellulaire, comme la formation de foyers de 53 BP1 en réponse à des agents endommageant l'ADN ou le comportement de 53 BP1 durant la mitose. Notre intérêt pour l'imagerie en 2D et 3D a commencé lorsque nous avons souhaité étudier comment différents traitements influençaient la mitose dans certaines lignées cellulaires.

Cette approche expérimentale nous permet d'étudier la réponse aux dommages de l'ADN et le maintien de la stabilité génomique plus facilement que les méthodes traditionnelles. De plus, vous pouvez utiliser cette méthode pour étudier comment certaines protéines interagissent dans diverses voies de signalisation et diverses lignées cellulaires. Le principal avantage de l'imagerie en temps réel par rapport aux techniques classiques telles que la cytochimie est qu'elle permet l'étude des protéines de réponse aux dommages de l'ADN en temps réel.

Il peut être difficile d'optimiser les bonnes conditions d'enregistrement. Cette démonstration permet d'observer les nombreuses petites étapes nécessaires pour assurer le succès. N'oubliez pas que la persévérance porte ses fruits lorsqu'il s'agit de minimiser le photoblanchiment, de trouver les bons intervalles d'enregistrement et la durée d'enregistrement appropriée, entre autres.

Transfecter ou transduire les lignées cellulaires appropriées avec les plasmides permettant l'expression des protéines de fusion mCherry et GFP. Maintenir les cultures sous sélection médicamenteuse et vérifier périodiquement l'expression des protéines fluorescentes la veille de l'acquisition des images. Récolter les cellules à l'aide de trypsine.

Ensuite, ensemencer des cultures de faible densité dans des plaques de 3,5 cm avec fond en verre pour plat à fluorescence. Ce protocole a été mis au point à l’aide d’un microscope confocal à disque tournant Zeiss Cell Observer SD, équipé d’un support Axio Observer Z1. Tout d’abord, vérifier que le gaz CO₂ est acheminé vers le module CO₂ du système d’incubation. Si le microscope est installé sur une table anti-vibrations Airtable, alors mettre en marche l’alimentation en air de la Airtable.

Activez maintenant l'alimentation pour le support du microscope, l'unité à disque rotatif, les caméras, les modules d'incubation, l'éclairage HXP, la platine motorisée, le laser argon et l'ordinateur. Allumez les interrupteurs des lignes laser à utiliser. Lancez le logiciel Axio Vision.

Le logiciel Avision peut être personnalisé avec des fenêtres et des menus déroulants spécifiques au microscope et aux composants qu'il contrôle. Ainsi, chaque interface utilisateur peut présenter un aspect différent. Environ une heure avant l'acquisition d'images, repérez les commandes de l'incubateur et activez le chauffage de la chambre supérieure et de la platine.

Régler la température à 37 degrés Celsius. Activer la commande de CO2 et régler le niveau à 5 %. Sélectionner l'objectif pour l'acquisition d'images dans cette étude. L'objectif nécessite l'utilisation d'un milieu d'immersion dont l'indice de réfraction est similaire à celui de l'eau.

Si vous devez acquérir des images de plusieurs positions pendant de longues périodes, veillez à appliquer suffisamment de milieu d’immersion afin que le dispositif ne s’assèche pas. Placez la boîte de culture sur la platine et amenez l’objectif en contact avec le fond à l’aide des commandes du microscope ou du logiciel. Dirigez la lumière émise vers les oculaires et sélectionnez le jeu de filtres en champ large approprié pour le signal fluorescent d’intérêt.

Observez maintenant à travers les oculaires. Mettez au point l'image et localisez un champ de cellules approprié à l'aide du logiciel ou des commandes du microscope. Dirigez la lumière émise vers le port équipé de l'unité confocale à disque tournant, au lieu des oculaires, dans le logiciel.

Activez le laser approprié pour cette étude. Pour chaque canal, réglez l'intensité du laser en ajustant le contrôle du filtre optique accordable kuo à un niveau adéquat. Ensuite, sélectionnez le miroir dichroïque et les filtres d'émission appropriés.

Ouvrez l'obturateur de l'unité à disque tournant. Sélectionnez maintenant la fenêtre d'observation en direct pour afficher le champ de vision actuel. Ouvrez ensuite la fenêtre de contrôle de la caméra.

Sélectionnez la caméra à utiliser et réglez le temps d'exposition à environ 100 millisecondes. Ajustez le pourcentage et le gain EM selon les besoins. Ouvrez également la commande de l'unité de disque tournant confocale et réglez la vitesse du disque tournant en entrant le temps d'exposition de la caméra qui a été défini pour capturer une image appropriée.

Cliquez sur « définir » pour verrouiller le changement. Ouvrez maintenant la fenêtre d'acquisition multidimensionnelle. Sélectionnez l'onglet canal et chargez ou sélectionnez les canaux appropriés définis pour les Flora Fours.

Pour garantir l'inscription des images, utilisez un miroir dichroïque commun pour les deux canaux. Réglez le logiciel sur la mise au point automatique. Passez à la fenêtre MDA et cliquez sur l'onglet pile ZS.

Sélectionnez la pile ZS à la position de focalisation actuelle. Réglez la plage pour une Zack de 10 microns et choisissez le nombre optimal de pas pour assurer un échantillonnage de Nyquist en profondeur Z. Cliquez maintenant sur démarrer et analysez l'image de la pile Z résultante. Sélectionnez l'onglet temps.

Définissez l'intervalle entre les points temporels d'acquisition et la durée totale de la session. Pour l'acquisition multipoint de plusieurs cellules dans la boîte, ouvrez la fenêtre MDA. Sélectionnez l'onglet position et vérifiez que l'option appliquer les paramètres avant ou après chaque point temporel par position est activée.

Maintenant, sélectionnez « marquer ». À l’aide de la vue en direct, déplacez la boîte et choisissez des champs appropriés. Cliquez sur « Démarrer » dans le menu d’acquisition multidimensionnelle pour commencer l’expérience et enregistrer une vidéo témoin.

Procédez à l'ajout du traitement approprié et enregistrez la vidéo expérimentale à des intervalles de temps déterminés pendant une durée définie. Pour cette lignée cellulaire et afin de suivre l'ensemble du processus de mitose, nous avons utilisé un intervalle de sept minutes et demie pendant quatre à cinq heures. Vous devrez déterminer les paramètres spécifiques adaptés à votre lignée cellulaire et à l'objet de votre étude.

Ouvrez le logiciel Velocity, créez et nommez une nouvelle bibliothèque, puis importez les fichiers vidéo expérimentaux pour visualiser les fichiers. Essayez d'utiliser le réglage de mise au point étendue et ajustez les vidéos selon les besoins. Velocity est doté d'une gamme d'outils permettant d'améliorer la qualité de vos images acquises.

Si les paramètres du microscope sont appropriés, cela permettra de gagner beaucoup de temps ultérieurement lors de la retouche. Il est souvent utile de réduire la résolution de vos images et d'ajuster la luminosité et le contraste ; vos besoins spécifiques varieront selon votre expérience. Pour visualiser les cellules en 3D, passez au réglage d'opacité 3D.

Ceci permet la rotation des cellules en 3D dans l'espace, offrant ainsi plusieurs perspectives des structures d'intérêt au sein des cellules. Films. Des images fixes peuvent être exportées vers divers types de fichiers selon les préférences de l'utilisateur Par rapport aux témoins. Les cellules de fibroblastes exposées au CPT ont formé des foyers en cinq à dix minutes et ont conservé ces foyers pendant toute la durée de l'enregistrement.

Curieusement, dans les cellules rénales embryonnaires humaines, la protéine 53BP1 se dissocie de la chromatine au début de la mitose, formant un léger halo autour des chromosomes en condensation. Lorsque la télophase se produit et que la mitose prend fin, la protéine 53BP1 s'agrége à nouveau en foyers distincts. Nous espérons que cette vidéo vous permettra d'étudier les relations spatiotemporelles des protéines impliquées dans la réponse aux dommages de l'ADN ainsi que dans d'autres voies cellulaires.

Par exemple, dans le domaine de la dynamique de la chromatine, cette technique a été utilisée pour étudier comment la liaison de 53 BP1 affecte le mouvement des extrémités télomériques de l'ADN. Après la création de cellules génétiquement modifiées, une imagerie en direct en deux et trois dimensions peut être réalisée en environ quatre à huit heures. Veillez à régler correctement les paramètres du microscope afin d'obtenir une imagerie optimale.