L'examen de sélection positive et négative thymique par cytométrie en flux

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier le développement thymique chez la souris par cytométrie en flux. Cela est réalisé en préparant des suspensions monocellulaires à partir du thymus et de la rate de la souris. Dans un deuxième temps, les thymocytes et les cytes sont marqués avec un cocktail d'anticorps permettant l'identification de populations thymiques spécifiques.

En fin de compte, la fréquence et le nombre des différentes populations de lymphocytes peuvent être évalués par analyse en cytométrie en flux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le développement des lymphocytes T, telles que quels gènes et voies sont importants pour générer un répertoire de cellules T fonctionnel tout en étant tolérant aux cellules. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le développement des cellules T dans le thymus, elle peut également être appliquée à l'examen du développement d'autres cellules immunitaires.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés lors de la conception de leurs mélanges d'anticorps pour la cytométrie en flux. Avant de commencer la dissection, placer un tamis en acier stérile dans une boîte de Pétri de 60 par 15 millimètres. Ajouter ensuite cinq millilitres de HBSS dans la boîte et conserver celle-ci sur de la glace afin de récolter le thymus.

Tout d'abord, utilisez une paire de forceps pour soulever l'extrémité inférieure du sternum et découvrir le diaphragme. Ensuite, en évitant le foie, incisez le diaphragme afin de détacher la cage thoracique, puis sectionnez la cage thoracique en direction ascendante de chaque côté. En prenant soin d'éviter les poumons et le cœur.

Utilisez maintenant la pince pour écarter doucement la cage thoracique vers l'arrière. Le thymus est un organe blanc bilobé situé au-dessus du cœur. Utilisez le bord plat de la pince pour saisir la partie inférieure des lobes.

Ensuite, retirer délicatement le thymus et le placer sur l'un des écrans en treillis préparés au préalable. Pour prélever la rate, pratiquer une incision dans le péritoine afin d'exposer la cavité abdominale. La rate est un organe rouge en forme de planche de surf situé du côté gauche de la cavité abdominale de la souris, sous le foie.

Ensuite, utilisez une paire de forceps pour extraire la rate et une autre pour détacher le tissu conjonctif. Placez ensuite la rate disséquée sur un tamis séparé. Utilisez maintenant le piston d'une seringue de trois millilitres pour broyer chaque organe sur son tamis jusqu'à ce qu'il ne reste que le tissu conjonctif et la graisse ; aspirez ensuite les cellules et le HBSS pour les transférer dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, rincez chaque membrane avec du HBS S3 frais trois fois. Puis, centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 335 ×g et à 4 °C. Après avoir aspiré le surnageant, resuspendez les cellules dans 500 µL de tampon de lyse CK pendant 10 minutes à température ambiante, tandis que les globules rouges spléniques sont en cours de lyse.

Suspendez les thymocytes à 20 × 10⁶ cellules par millilitre dans du tampon fax, puis mettez-les de côté sur de la glace. Ajoutez maintenant cinq millilitres de HBSS pour rétablir l'isotonie après avoir centrifugé à nouveau les cellules ; resuspendez le culot exempt de globules rouges à 20 × 10⁶ cellules par millilitre dans du tampon fax. Commencez cette étape par Ali Watting.

Quatre fois 10 puissance 6 des THYMOCYTES réservés par échantillon de cytométrie en flux dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. Ensuite, ajouter des cellules dans les puits d'une plaque de 96 puits pour les contrôles de compensation. Puis bloquer les récepteurs FC dans chacun des échantillons cellulaires par incubation avec l'anticorps anti-CD1632 pendant 10 minutes sur glace.

Centrifuger maintenant la plaque, puis éliminer le liquide des puits en la retournant d’un coup sec au-dessus d’un évier. Resuspendre ensuite chaque puits dans 200 microlitres de tampon fax et répéter le lavage. Incuber ensuite les échantillons expérimentaux avec 200 microlitres de cocktail d’anticorps ou d’anticorps marqués avec un seul fluorochrome pour les contrôles de compensation. Le tout dans du tampon fax, sur glace et à l’abri de la lumière.

Après 30 minutes, lavez les cellules deux fois avec du tampon fax, puis, après avoir resuspendu les cellules dans du tampon fax, transférez les échantillons dans des tubes fax chez des modèles transgéniques TCR physiologiques et des souris de type sauvage. La sélection positive débute au stade double positif brillant avant de passer au stade double positif terne. Après la rencontre avec l'antigène, les thymocytes double positif ternes entrent ensuite dans un stade transitoire CD quatre positif CD huit faible avant de devenir CD quatre.

Les thymocytes simples positifs ou les thymocytes simples positifs CD8 mûrs sont caractérisés par leur forte expression du TCR et la perte de CD24. Alors que le profil CD8 par rapport à CD4 peut révéler des défauts dans la sélection positive, l'analyse de TCRβ par rapport à CD69 ou CD5 peut fournir des informations supplémentaires sur la localisation du défaut. CD69 et CD5 sont tous deux surexprimés après la stimulation du TCR, les interactions plus fortes induisant une expression plus élevée de ces marqueurs.

Dans ce tracé TCR bêta en fonction de CD69 chez une souris de type sauvage, la population TCR β faible CD69 négative représente une population de thymocytes doublement positifs pré-sélection. En revanche, la population TCR β intermédiaire CD69 positive correspond à une population transitoire juste après l'engagement du TCR et est composée de doublement positifs intenses, ainsi que de quelques doublement positifs faibles et de cellules CD4 positif CD8 faible. Ici, la population TCR β élevée CD69 positive illustre la population cellulaire juste après la sélection positive, constituée de doublement positifs faibles CD4 positif, CD8 faible et de cellules CD4 simple positif.

Enfin, ce phénotype TCR bêta élevé CD 69 négatif indique une population cellulaire plus mature, composée principalement de cellules simples positifs pour CD quatre et CD huit. L'absence des populations TCR bêta intermédiaire CD 69 positif et TCR bêta élevé CD 69 positif peut indiquer un défaut de sélection positive. Des modifications du ratio entre les cellules simples positifs CD quatre et les cellules simples positifs CD huit au sein de la population TCR bêta élevé CD 69 négatif peuvent suggérer des altérations dans l'engagement lignagé.

La perte des populations TCR bêta élevé CD 69 positif et TCR bêta élevé CD 69 négatif pourrait refléter des problèmes de survie après la sélection positive. L'analyse du TCR bêta en fonction du CD cinq constitue une autre stratégie permettant d'identifier les populations avant et après la sélection positive. Ces deux premières populations se composent principalement de thymocytes double positifs intenses.

La population TCR bêta faible CD cinq faible représente les thymocytes doubles positifs pré-sélectionnés, et la population TCR bêta intermédiaire CD cinq intermédiaire est composée des cellules qui initient la sélection positive. Une production altérée de cette population ou de la précédente suggère un défaut de sélection positive. La population TCR bêta intermédiaire CD cinq élevée, en revanche, représente les thymocytes en cours de sélection positive et se compose principalement de doubles positifs atténués et de cellules CD quatre positives.

CD huit lymphocytes thymiques faibles. La population TCR bêta forte CD cinq forte se compose principalement de thymocytes post-sélection positive. Modifications du ratio de CD quatre, simple positif à CD huit.

Des cellules simples positives au sein de cette population, malgré des populations précédentes normales, peuvent suggérer des altérations dans l'engagement lignagé. En outre, l'absence de cette population peut indiquer une survie réduite des thymocytes après la sélection positive, car la sélection négative implique l'élimination de petites populations spécifiques aux antigènes. Les défauts dans ce processus sont mieux observés à l'aide de souris transgéniques pour le TCR : dans les thymocytes de souris HY CD4 exprimant le TCR transgénique H-Y-TCR, ceux-ci peuvent être détectés à l'aide de l'anticorps monoclonal T3.7.

Le TCR H-Y reconnaît l'antigène HY spécifique du mâle présenté par la molécule de CMH de classe I H-2Dᵇ. Ainsi, chez les souris mâles HY CD4, les thymocytes exprimant le TCR H-Y subissent une sélection négative, comme en témoigne une réduction du nombre de thymocytes doubles positifs T3.70⁺, ainsi qu'une diminution plus marquée du nombre de thymocytes simples positifs CD8⁺ T3.7⁺. En revanche, chez les souris femelles HY CD4, ces thymocytes subissent une sélection positive conduisant à la génération de lymphocytes T simples positifs CD8⁺ T3.7⁺.

Bien qu'une réduction du nombre de thymocytes doubles positifs soit indicative d'une sélection négative, l'absence de thymocytes simples positifs spécifiques de l'antigène constitue la mesure la plus précise. Un examen approfondi des rares thymocytes T3.70 positifs, CD8 simples positifs, chez les souris HY CD4 mâles révèle que la majorité sont des cellules immatures CD24 élevées. Alors que la majorité des thymocytes T3.70 positifs, CD8 simples positifs, chez les souris HY CD4 femelles ont atteint la maturité et sont CD24 faibles, ce qui apporte un soutien supplémentaire à l'existence d'une sélection négative chez les souris HY CD4 mâles.

Un inconvénient des modèles transgéniques de TCR est qu'il est difficile de caractériser davantage la sélection positive en identifiant des populations selon l'expression du TCR et de CD 69 ou de CD cinq, en raison de l'expression élevée du TCR tout au long du développement thymocytaire. Chez les souris HY CD quatre femelles, il existe une importante population de thymocytes doubles positifs exprimant T trois point 70 qui subissent une sélection positive, comme en témoigne l'augmentation de la population positive pour CD 69 par rapport au type sauvage. La sélection négative implique un stimulus TCR d'affinité plus élevée que la sélection positive. Cela se manifeste par une expression plus forte de CD 69 sur les thymocytes doubles positifs T trois point 70 positifs chez les souris HY CD quatre mâles, entraînant un décalage du pic de l'histogramme vers la droite.

Des tendances similaires sont observées concernant l'expression de CD cinq lors de l'analyse de la sélection thymique chez des souris génétiquement modifiées. L'analyse de l'expression de CD 69 ou de CD cinq permet de déterminer si le défaut réside dans la signalisation du TCR ou dans une conséquence en aval de la stimulation du TCR. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures et demie pour la préparation et la coloration des cellules, plus une heure supplémentaire pour l'acquisition des données sur le cytomètre en flux.

Si elle est réalisée correctement, chaque souris supplémentaire ajoutera environ 30 minutes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de manipuler délicatement les thymocytes et de s'assurer d'avoir planifié au préalable la stratégie de marquage. Suivre cette procédure.

D'autres tests, tels que des tests de destruction cellulaire ou des tests de production de cytokines, peuvent être réalisés afin de répondre à des questions supplémentaires, comme de savoir si les thymocytes exportés fonctionnent correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser le développement des sites thymiques à l'aide de la cytométrie en flux.