Un workflow d'imagerie à haute teneur pour étudier Grb2 complexes de signalisation par clonage d'expression

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier les partenaires d'interaction de grab two par clonage d'expression de CD NA et observation des modifications du grab two marqué par une protéine fluorescente verte. Ceci est réalisé en préparant d'abord une bibliothèque de CD NA à partir de lysats bactériens, puis, dans une deuxième étape, les ADNc sont transfectés dans des cellules rénales embryonnaires humaines, ce qui entraîne l'expression du construit rapporteur ainsi que des gènes d'intérêt.

Ensuite, les plaques transfectées sont analysées au microscope Opera afin de visualiser les changements de la localisation de Grab two dans l'ensemble des cellules. Les résultats obtenus montrent le recrutement, médié par le récepteur du facteur de croissance épidermique, de Grab two marqué par la GFP vers les endosomes, selon la microscopie de fluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le système deux-hybride est que les partenaires d'interaction de Grab two peuvent être identifiés dans une situation physiologique qui tient compte de la distribution subcellulaire des partenaires d'interaction.

Bien que cette méthode puisse être utilisée pour identifier la transduction de signal par Grab deux, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme d'autres protéines d'intérêt. La bibliothèque d'ADNc est fournie sous forme de clones bactériens individuels dans des stocks de glycérol.

Dans un format 96 puits, utilisez la commande re ray dans le menu du sélecteur du Hudson Rapid pick light. Prélève des clones bactériens à partir de la plaque source et inoculez-les dans 1,5 ml de milieu LB amp dans une plaque 96 puits profonds. Scellez hermétiquement les plaques à puits profonds avec un scellé perméable aux gaz et incubez-les toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un agitateur. Le jour suivant, centrifugez les plaques à puits profonds contenant les bactéries à 2000 tr/min pendant 20 minutes.

À l’aide d’adaptateurs de plaque dans une centrifugeuse de table, aspirez le milieu des puits en laissant intact le culot bactérien. Ensuite, configurez le plateau de la station d’automatisation Tecan Freedom Evo comme indiqué ici. Répartissez les solutions destinées à la préparation du plasmide dans les cuvettes une à cinq et placez une plaque à puits profonds sur le plateau.

Placer une cuvette multicellule contenant une solution d'alucine à côté de la plaque à puits profonds ; charger les embouts dans les supports d'embouts. Assembler le système de vide. Placer la plaque de liaison de plasmide à l'intérieur du système et la plaque filtrante pour plasmide au-dessus du système. Resuspendre les culots avec 250 microlitres de solution n°1.

Le tampon de resuspension Resus en pipettant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Il est essentiel de s'assurer que les culots sont complètement resuspendus pour la réussite de cette procédure. Un agitateur peut être utilisé si le pipettage répété ne parvient pas à resuspendre complètement le culot.

Une fois que les culots sont complètement resuspendus, lyser les bactéries en ajoutant 250 microlitres de solution tampon de lyse. Fermer la plaque et l'inverser pour permettre un mélange complet. Programmer une minuterie sur deux minutes.

Ensuite, ajoutez 350 microlitres de la solution trois, le tampon de neutralisation. Scellez la plaque et retournez-la trois fois.

Transférez les lysats bactériens vers les plaques filtrantes pour plasmide. Appliquez le vide pendant cinq minutes. Retirez la plaque filtrante et placez la plaque de liaison au-dessus du manifold.

Appliquer le vide pendant une minute. Ajouter 500 microlitres de tampon de lavage supplémentaire et appliquer le vide pendant deux minutes. Ajouter 900 microlitres de solution de tampon de lavage quatre et appliquer le vide pendant deux minutes.

Ensuite, ajoutez 900 microlitres de solution de lavage quatre à nouveau et appliquez le vide pendant 15 minutes. Placez la plaque de collecte de l'ADN dans le système de filtration. Ajoutez 100 microlitres de tampon d'élution sur la plaque de liaison et incubez pendant deux minutes.

Appliquer le vide pendant 10 minutes. Enfin, retirer la plaque de collecte et mesurer la concentration d'ADN à l'aide du NanoDrop 8 000. Généralement, un rendement d'environ 100 nanogrammes par microlitre peut être attendu avec cette méthode pour commencer cette procédure.

Après que les cellules HEK 293 ont été trypséisées et comptées, utilisez un distributeur automatisé pour distribuer deux fois 10 à la puissance 4 cellules dans chaque puits d'une plaque Perkin Elmer View. Incubez les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour la transfection.

Utilisez le distributeur automatique de liquides pour préparer le mélange suivant dans chaque puits d'une plaque 96, à fond rond : 100 nanogrammes de GFP. Ajoutez deux plasmides d'ADN avec 100 nanogrammes d'ADNc dans 25 microlitres de milieu sans sérum. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de milieu sans sérum contenant 0,5 microlitre de transfectant par puits, puis démarrez le chronomètre pour 30 minutes.

Après 30 minutes, transférez 50 microlitres du mélange de transfection d'ADNc vers les cellules. Utilisez une méthode de distribution douce. Incubez les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Pour commencer l'acquisition d'images, lancez le logiciel Opera. Sélectionnez l'onglet de configuration, puis l'objectif 20 fois et le type de plaque approprié. Assurez-vous que le collier est réglé sur la valeur correcte au niveau de l'objectif afin de permettre la mise au point avec différents types de plaques.

Ensuite, sélectionnez l'onglet microscope. Définissez l'exposition un comme le laser fite 4 88 et l'exposition deux comme le laser UV 365. Activez le filtre UV sur les deux expositions et attribuez l'exposition.

Un pour la caméra un et la pose. Deux pour la caméra deux. Régler les temps de pose à 800 millisecondes pour la pose un et à 40 millisecondes pour la pose.

Deux, sélectionnez l'exposition, puis réglez la hauteur de mise au point sur zéro micron. Sélectionnez la mise au point une fois celle-ci effectuée. Exposez la caméra un.

Réglez la hauteur de mise au point pour optimiser le plan d'exposition et cliquez sur prendre la hauteur. Enregistrez les paramètres d'exposition, répétez pour l'exposition. Deux, sélectionnez l'onglet définition de l'expérience, créez la disposition et la sous-disposition.

Faites glisser et déposez la disposition, l'exposition, l'image de référence, le fichier de correction d'inclinaison, le rognage et la sous-disposition appropriés. Enregistrez l'expérience. Sélectionnez l'onglet d'expérience automatique et acquérez les images dans des conditions normales.

Grab deux est localisé dans toute la cellule. Après stimulation d'un récepteur du facteur de croissance, il transloque vers la membrane plasmique puis est internalisé dans les endosomes. Dans cette figure, le panneau supérieur montre des cellules CO M six transfectées de façon transitoire avec Grab deux GFP, et comme prévu, la fluorescence est répartie dans toute la cellule.

Cependant, dans les cellules transfectées de façon transitoire avec GFP grab deux, le récepteur de surface cellulaire IT EGFR grab deux se rélocalise vers des structures de type endosome, comme illustré dans le panneau inférieur. Ainsi, lors de l'application d'une bibliothèque à l'échelle du génome, on peut s'attendre à l'identification de nouvelles protéines de surface cellulaire liant grab deux. Cette méthode n'est pas limitée à la détection de protéines de surface cellulaire.

Par exemple, la DYNAMINE deux du GPA, qui est impliquée dans l'endocytose médiée par grab deux, induit une translocation de grab deux. Dans cette expérience, grab deux marqué par la GFP a été codansfecté avec DNM deux dans des cellules HEC 2 93 T. La redistribution de grab deux-GFP vers des structures de type endosomique est illustrée par les cellules situées à l'intérieur des cercles rouges.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes comme l'immunoprécipitation ou les dosages biochimiques peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que savoir si l'interaction est directe ou indirecte. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser le clonage d'expression afin d'identifier les interactions protéiques subcellulaires.