Cytométrie de masse: Protocole pour Tuning quotidien et échantillons cellulaires course sur un cytomètre de masse CyTOF

L'objectif principal de cette procédure est de démontrer le réglage quotidien approprié et l'analyse des échantillons sur un instrument CyTOF. Tout d'abord, l'appareil est assemblé et mis sous tension. Ensuite, les paramètres de l'instrument sont optimisés pour le réglage afin d'obtenir un signal maximal.

La machine est alors prête à analyser les échantillons. Dans la dernière étape, la machine est nettoyée et arrêtée. En définitive, des données cellulaires optimales peuvent être obtenues selon des exigences temporelles spécifiques.

La démonstration visuelle de cette technique est essentielle. La configuration quotidienne, les procédures de réglage et de nettoyage sont difficiles à apprendre à partir du manuel, car plusieurs étapes logicielles simultanées sont impliquées.

Vous devez acquérir de l'expérience pour apprécier les niveaux de bruit de fond appropriés et les intensités de signal. Au moins 15 minutes avant de commencer une expérience, ouvrez le logiciel CyTOF et sélectionnez la configuration de l'instrument. Ensuite, dans l'onglet du boîtier de cartes, cliquez sur le bouton d'activation du chauffage pour permettre au four de la chambre de pulvérisation d'atteindre 200 degrés Celsius.

Remplacez la seringue dans la pompe à seringue par une seringue neuve remplie d'eau Milli-Q. Ensuite, nettoyez le nébuliseur en effectuant une rétrodiffusion avec 5 % de citron deux fois par chaque port. Pour éliminer tout résidu de citron, répétez la rétrodiffusion avec de l'eau Milli-Q.

Ensuite, ouvrez la vanne du réservoir de gaz argon, ce qui entraîne l'allumage du témoin lumineux Argonne à l'avant de la machine. Puis, reliez le nébuliseur à l'entrée du gaz de compensation et connectez le nébuliseur au tube d'introduction du liquide. Insérez l'extrémité du nébuliseur dans l'ouverture blanche du manteau chauffant, dans l'onglet du contrôleur RFG de la fenêtre de configuration de l'appareil.

Cliquez sur démarrer le plasma, puis cliquez sur OK. Une fois le démarrage terminé, cliquez à nouveau sur OK dans la fenêtre contextuelle. Ensuite, allumez la pompe à seringue.

Lors du remplissage de la seringue, appuyez sur le bouton d'arrêt plutôt que sur le bouton de pause pour réinitialiser le compteur de volume. Avant d'étalonner le cytomètre à masse, assurez-vous qu'il a chauffé pendant 20 minutes. Une fois que l'appareil est stabilisé, cliquez sur le bouton des paramètres d'acquisition pour ouvrir la fenêtre des paramètres d'acquisition des données. Dans l'onglet des analytes.

Cliquez sur le tableau périodique pour ouvrir le panneau de sélection des isotopes. Sélectionnez ensuite les isotopes présents dans la solution d’étalonnage DVS Sciences indiqués dans le mode d’emploi, puis cliquez sur Enregistrer. Cliquez ensuite sur le bouton isotopes par lecture pour ouvrir la fenêtre des masses par lecture.

Sélectionnez le nombre d'impulsions et redimensionnez l'axe des y en entrant un nouveau nombre, puis en appuyant sur Entrée. Remplissez maintenant une seringue verte de un millilitre norm inject avec la solution d'étalonnage. Tournez le sélecteur de prise d'échantillon vers la position de chargement.

Injectez 450 microlitres de solution d'ajustage, puis tournez le sélecteur sur injecter. Attendez que les isotopes de la solution d'ajustage apparaissent sous forme de traînées sur cet affichage. Les signaux dans la région du temps de vol, de 9 400 à 9 800, sont dus aux isotopes du xénon présents dans le gaz argon.

Revenez maintenant aux masses par fenêtre de lecture et cliquez sur le bouton lecture vert. Chaque ligne colorée représente des isotopes sélectionnés à partir de l'onglet des analytes. Lorsque les niveaux d'isotopes sont stables, réglez le courant en sélectionnant le courant souhaité dans le menu déroulant de l'onglet paramètre de la fenêtre de paramètres d'acquisition des données.

Dans la fenêtre de départ, saisissez zéro pour l'arrêt, saisissez 10. Pour la valeur du pas, saisissez 0,5, et pour le temps de stabilisation, saisissez 200. Cliquez ensuite sur enregistrer.

Ensuite, revenez à la fenêtre des masses par lecture et cliquez sur lecture. Après avoir noté les positions des pics des isotopes, accédez à l'onglet de configuration du canal DAC dans la fenêtre de configuration de l'appareil. Faites défiler vers le bas jusqu'à la section courant et saisissez la valeur du pic de l'isotope.

Cliquez sur « définir la valeur actuelle du courant », puis enregistrez. Ensuite, modifiez le menu déroulant pour sélectionner le gaz de compensation. Saisissez 0,55 dans la fenêtre de départ, 0,95 dans la fenêtre de fin, 0,05 dans la fenêtre de valeur de pas et 200 dans la fenêtre du temps de stabilisation.

Cliquez sur enregistrer. Après être revenu à la fenêtre « masses par lecture » et avoir cliqué à nouveau sur lecture, l'axe des abscisses affichera désormais le débit du gaz de balayage. Notez les valeurs correspondant aux pics des signaux des isotopes et observez l'augmentation rapide du signal GD 1 55 vers la fin.

Ensuite, revenez à l'onglet de configuration du canal DAC. Faites défiler vers le bas jusqu'à la section de réglage du gaz et saisissez la nouvelle valeur de pic isotopique. Cliquez sur « Définir la valeur de courant actuelle ».

Ensuite, cliquez à nouveau sur enregistrer pour enregistrer le rapport entre l'isotope souhaité et l'oxyde. Commencez par une deuxième injection de 450 microlitres de solution d'ajustage. Puis, dans l'onglet paramètres, sélectionnez « temps » dans le menu déroulant, saisissez zéro dans la fenêtre de début, 10 dans la fen游戏副本 de fin, 1 dans la fenêtre de valeur de pas et 200 dans la fenêtre de stabilisation.

Après avoir cliqué sur lecture dans la fenêtre des masses par lecture, utilisez le curseur pour relever la valeur la plus élevée pour TM 1 69 ou TB 1 59, ainsi que la valeur GD 1 55. Injectez ensuite trois millilitres d’eau Milli Q à travers la boucle d’échantillonnage, suivis de 500 microlitres de solution de lavage DVS. Dans l’onglet d’étalonnage de masse, cliquez sur exécuter pour suivre l’avancement du lavage de nettoyage jusqu’à ce que l’intensité des traînées commence à diminuer.

Ensuite, ajoutez trois millilitres d'eau milli-Q et surveillez jusqu'à ce que les stries soient réduites à des niveaux de fond. Commencez par saisir les isotopes de l'échantillon comme cela vient d'être démontré pour les isotopes de la solution d'étalonnage, puis cliquez sur enregistrer. Ouvrez ensuite la fenêtre d'acquisition et modifiez les paramètres d'acquisition selon les besoins en fonction du volume d'échantillon.

Par exemple, un échantillon de 450 microlitres remplira la boucle d'échantillonnage et nécessitera 600 secondes pour s'exécuter afin de tenir compte des retards dans l'acquisition des données cellulaires. Réglez le délai d'acquisition à au moins 30 secondes et le délai de stabilité du détecteur à au moins 20 secondes avant de lancer l'analyse. Lavez les échantillons cellulaires au moins deux fois avec de l'eau milliQ, puis resuspendez l'échantillon à une concentration maximale de 10 puissance 6 cellules par millilitre et filtrez la solution cellulaire obtenue à travers un tamis cellulaire de 35 micromètres.

Pour éliminer tous les agrégats. Saisissez maintenant un nouveau nom de fichier pour l'échantillon actuel. Notez que tous les fichiers doivent être enregistrés sur le lecteur E.

Ensuite, positionnez la vanne de la boucle d'échantillonnage sur « load », injectez l'échantillon, remettez la vanne de la boucle d'échantillonnage en position « inject », puis cliquez sur « run » dans la fenêtre d'acquisition. Les cellules apparaîtront dans la fenêtre de visualisation sous forme de groupes horizontaux de marques dans chaque canal isotopique vertical et présenteront la meilleure résolution aux alentours de 300 à 500 cellules par seconde, comme illustré ici.

Lorsque l'acquisition des données de l'échantillon est terminée, une fenêtre contextuelle apparaîtra. Cliquez sur OK pour confirmer la fin de l'analyse de l'échantillon, puis injectez au moins 500 microlitres d'eau MQ entre chaque échantillon afin de minimiser au maximum toute contamination croisée et nettoyer l'appareil. Après utilisation, injectez 450 microlitres de solution de lavage dans la boucle d'échantillonnage. Surveillez la libération du métal libre, puis rincez la boucle d'échantillonnage avec trois millilitres d'eau Milli Q en contrôlant le lavage jusqu'à ce que des niveaux de traînées de fond soient atteints.

Ensuite, pour arrêter l'appareil, sélectionnez l'onglet du contrôleur RFG dans la fenêtre de configuration de l'instrument et cliquez sur arrêter le plasma. Une fois la procédure terminée, cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle, qui recommande de retirer le nébuliseur sous l'onglet du bâti de cartes. Éteignez le chauffage, fermez la vanne de l'alimentation en argon, puis tirez délicatement vers l'arrière sur le nébuliseur pour le retirer de la chambre de pulvérisation.

Ensuite, dévissez le tube d'introduction de l'échantillon et mettez-le de côté. Dévissez le raccord d'introduction du gaz de compensation jusqu'à ce qu'il se desserre légèrement, puis retirez le nébuliseur. Enfin, en utilisant la même seringue et le même tube qu'illustré précédemment, nettoyez les deux orifices du nébuliseur avec de la solution à 5 % de Citron et rangez le nébuliseur recouvert de solution à 5 % de Citron jusqu'à la prochaine utilisation.

Un lavage adéquat du cytomètre à masse avec de l’eau UE et une solution de lavage DVS permet de réduire les niveaux d’absorption métallique au niveau du tube et des autres parties de l’appareil, contribuant ainsi à diminuer tout fond observé sur ces graphiques. Un étalonnage incorrect, représenté par la ligne magenta, augmente significativement la formation d’oxydes à m plus 16 par rapport à l’échantillon correctement étalonné, illustré par la ligne bleu foncé. Cela a pour effet de réduire légèrement les signaux souhaités à m et d’augmenter de manière importante les interférences de fond indésirables à m plus 16.

Un lavage approprié et une dilution adéquate des échantillons dans de l’eau Milli Q permettront d’obtenir un fond minimal et la meilleure résolution cellulaire, tout en tenant compte du besoin de rapidité. Comme dans les données d’une expérience représentative montrée ici, des billes de polystyrène contenant du lanthane 139 naturel, du SODIUM 140, du TERBIUM 159, du DYSMIUM 169 et du LUTÉTIUM 175 ont été analysées en mode d’acquisition cellulaire. Les données ont été analysées à l’aide de FlowJo, et les débris provenant d’éventuelles billes rompues ont été éliminés par fenêtrage.

L’échantillon correctement ajusté s’est révélé être à un débit de 0,74 litre par minute, comme illustré par la ligne bleu foncé. Des intensités de signal plus élevées ont été observées à ce débit par rapport aux débits inférieurs, et cet échantillon correctement ajusté présentait un signal plus élevé aux masses métalliques M et un signal moindre aux masses oxydées m + 16, par comparaison avec les signaux incorrectement ajustés. Un agrandissement du signal aux masses M LANTHANUM 139 et THULIUM 169 est montré ici.

Remarquez que le débit du gaz de compensation affecte l'intensité du signal du LANTHANUM 1 39 plus que celle du signal du thulium 1 69. Ces graphiques montrent le signal aux masses d'oxydes m + 16, soit 1 55 et 180 5, correspondant respectivement aux oxydes LANTHANUM 1 39 + OH 16 et thulium 1 69 + OH 16. Remarquez que le débit du gaz de compensation augmente beaucoup plus le signal à la masse 1 55 que le signal à la masse 180 5, car le LANTHANUM 1 39 s'oxyde plus facilement que le thulium 1 69.

Les intensités des signaux m et m plus 16 en fonction du débit du gaz de compensation sont représentées ici. Les icônes pleines représentent la masse M, tandis que les icônes ouvertes représentent la masse M plus 16. Les couleurs des lignes correspondent à la masse M respective. Notez que les intensités des signaux du LANTHANUM 1 39 et du PRASIODYME 1 41 sont fortement influencées par le débit du gaz de compensation, au point qu'une quantité supérieure d'oxyde de masse m plus 16 peut être présente par rapport à la masse M. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment démarrer correctement le CyTOF, l'ajuster adéquatement, analyser vos échantillons, puis nettoyer et arrêter correctement l'appareil à la fin de vos séances quotidiennes.