Préparation de lignées cellulaires pour Knockdown conditionnelle de l'expression génétique et évaluation des effets sacrifiés sur la mort cellulaire induite par E4orf4

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer l'effet de l'extinction d'ACF one ou de SNF two H sur la mort cellulaire induite par E four or four. Ceci est réalisé par la génération de lignées cellulaires dans lesquelles l'expression de l'ARNi ciblant ACF one ou SNF two H est activée de manière conditionnelle par l'ajout de doxycycline, entraînant une réduction des niveaux de la protéine ACF one ou SNF two H. Dans une deuxième étape, les cellules des lignées obtenues sont traitées avec de la doxycycline afin de réduire l'expression d'ACF one ou de SNF two H, ou restent non traitées.

Ensuite, E quatre ou quatre est exprimé dans les cellules avec ou sans ACF un ou SNF deux H résistant à la S-H-R-N-A. Afin d'étudier l'effet d'ACF un ou SNF deux H sur la mort cellulaire induite par E quatre ou quatre, des résultats sont obtenus qui montrent l'impact des niveaux d'ACF un ou SNF deux H sur la toxicité d'E quatre ou quatre, basée sur le comptage des noyaux présentant une morphologie apoptotique à l'aide du test JY. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes, telles que la transfection transitoire d'ARN, est que toutes les cellules expriment la S-H-R-N-A et que le pourcentage de cellules coexprimant conjointement avec le plasmide traditionnel est plus élevé. Cette méthode permet de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la mort cellulaire induite par if 4 0 4, mais elle peut également être appliquée à l'étude d'autres protéines pro-apoptotiques.

En plus d'Ana Lafe, un chercheur de mon laboratoire démontrera certaines parties de cette procédure. Pour commencer la procédure de génération de lignées cellulaires inductibles, ensemencer les cellules T-Rex 293 à une densité d'environ cinq fois 10⁶ cellules par plaque de 10 centimètres dans huit millilitres de DMEM contenant du sérum, sans tétracycline et avec cinq microgrammes par millilitre de bléomycine, puis incuber les plaques toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, remplacer le milieu par huit millilitres de milieu frais avant la transfection. Le plasmide utilisé pour la transfection est le plasmide pSuperior-neo plus GFP, codant pour ACF1 ou SNF2H-SH-RNA, sous le contrôle d'un promoteur H1 inductible par la tétracycline, ainsi que le gène de résistance à la néomycine fusionné au GFP, sous le contrôle d'un promoteur PGK constitutif.

Ajouter 10 microgrammes d'ADN plasmidique à 500 microlitres de chlorure de sodium à 150 millimolaire et vortexer. Ajouter ensuite le réactif jet PY à raison de deux microlitres par microgramme d'ADN dans un autre tube contenant 500 microlitres de chlorure de sodium à 150 millimolaire et vortexer. Ajouter la solution jet pie à l'ADN et mélanger soigneusement par vortexage.

Incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Après 15 minutes, ajouter délicatement au moyen d'une pipette les complexes d'ADN sur les plaques de 10 centimètres contenant des cellules à une confluence de 70 à 80 %. Les cellules T-Rex 2 9 3 seront mélangées le jour suivant.

Remplacez le milieu par un milieu sélectif, dans cet exemple du DMEM comme précédemment, contenant 500 microgrammes par millilitre de G quatre 18. Pendant les deux prochaines semaines, surveillez les cellules. Remplacez le milieu sélectif par un milieu frais similaire tous les trois à quatre jours jusqu'à l'apparition de colonies.

Identifier les colonies à l'œil nu et marquer leur emplacement sur le fond de la boîte à l’aide d’un marqueur de couleur. Vérifier au microscope que les colonies sont bien séparées. Les colonies peuvent être isolées dès qu’elles sont suffisamment grandes pour être visualisées sans microscope.

Pour la réussite de cette procédure, il est important de choisir des colonies bien séparées lors de l'isolement des colonies. Dans une hotte stérile, aspirez le milieu à partir de la boîte. Rincez délicatement avec du PBS et aspirez soigneusement tout liquide résiduel.

Ajoutez trois microlitres de trips à 0,25 % dans l'EDTA à une colonie sur la plaque en pipetant répétitivement les trips jusqu'à ce que les cellules se détachent de la plaque. Transférez les cellules dans un milieu sélectif dans un puits d'une plaque de 24 puits. Répétez cette opération pour plusieurs autres colonies sur la plaque.

Faire croître les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, jusqu'à ce qu'elles recouvrent le puits. Ensuite, diviser les cellules de chaque colonie d'origine en trois puits distincts dans une plaque de 12 puits séparée et incuber toute la nuit le jour suivant. Remplacer le milieu dans une plaque par un milieu contenant un microgramme par millilitre de doxycycline provenant d'une solution mère préparée dans de l'eau doublement distillée.

Remplacer le milieu dans une plaque témoin par du milieu sans doxycycline. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Les cellules provenant d'un puits traité et d'un puits non traité sont ensuite récoltées pour une analyse par immunotransfert afin de déterminer l'efficacité de l'extinction d'ACF1 ou de SNF2H ; un résultat représentatif est montré ici.

Cette immunotransfert a été marquée avec des anticorps dirigés contre SNF deux H et la tubuline alpha. Cette dernière servant de témoin de chargement pour les deux clones. Les clones numéro quatre et numéro cinq ont montré une forte réduction de SNF deux H après induction par la doxycycline et ont donc été choisis pour être utilisés dans l'expérience d'interférence par ARN, qui sera démontrée dans le prochain segment.

Les cellules non traitées de la troisième plaque serviront à amplifier la lignée cellulaire sélectionnée, et des aliquotes de ces cellules seront ensuite congelées. Pour une utilisation ultérieure afin d'induire une inhibition d'ACF un ou de SNF deux, cultiver les cellules en milieu sélectif dans des plaques de 10 centimètres, ajouter de la doxycycline à une concentration de un microgramme par millilitre dans la moitié des plaques et incuber à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant 48 à 72 heures. Chaque groupe de plaques doit fournir suffisamment de cellules pour 12 plaques de six centimètres, incluant deux répliques pour le test DPI pour chaque point, ainsi qu'une plaque destinée à l'analyse par immunotransfert pour chaque échantillon.

48 à 72 heures après l'induction, détacher les cellules de chaque groupe à l'aide de trypsine, puis, après les avoir comptées, ensemencer 1,5 fois 10 à la puissance 6 cellules par plaque de six centimètres dans le même milieu, avec ou sans doxycycline. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant la nuit ; le jour suivant, transfecter les cellules, comme indiqué.

Les cellules non traitées et celles traitées à la doxycycline sont transfectées en triple dans quatre conditions différentes. Une avec un plasmide vide et un plasmide exprimant GFP, deux avec le plasmide vide ainsi qu’un vecteur exprimant ACF résistant à la SHRA, un GFP ou SNF deux HGFP, trois avec un plasmide codant pour E quatre ou quatre et un plasmide exprimant GFP, et quatre avec le plasmide codant pour E quatre, tous les quatre. Après la transfection, incuber toutes les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit.

Le jour suivant la transfection des cellules, extraire les protéines d'une plaque par échantillon pour une analyse par immunoblot afin de vérifier que ACF un ou SNF deux H a été efficacement inhibé et que E quatre ou quatre a été exprimé de manière équivalente dans les différents échantillons. Les 16 plaques restantes seront utilisées pour le test DPI. Aspirer le milieu des plaques destinées au test DPI et laver délicatement les cellules avec du PBS dans une hotte chimique.

Ajoutez un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % préparé dans du PBS pour recouvrir les cellules, puis incubez pendant 15 minutes à température ambiante sans agitation. Aspirez le paraformaldéhyde et rincez avec du PBS en agitant à température ambiante pendant cinq minutes. Répétez le rinçage deux fois supplémentaires pour un total de trois rinçages ; après le troisième rinçage au PBS, ajoutez de l’éthanol à 80 % conservé à moins 20 degrés Celsius et incubez à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une heure.

Aspirez l'éthanol et lavez les cellules deux fois avec du PBS en agitant à température ambiante pendant cinq minutes à chaque fois, puis une fois pendant cinq minutes à température ambiante avec du PBS contenant 0,5 % de BSA et 0,05 % de Tween 20 ou P-B-S-B-T. Effectuez également cette étape avec agitation pour éviter la liaison non spécifique des anticorps. Bloquez les cellules dans un millilitre de tampon P-B-S-B-T contenant 10 % de sérum de chèvre pendant 20 minutes, en agitant à température ambiante.

Ensuite, laver les cellules deux fois dans du P-B-S-B-T, cinq minutes par lavage. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire, dans ce cas un anticorps spécifique de E quatre ou quatre, dans un millilitre de P-B-S-B-T pendant une heure sous agitation à température ambiante. Puis laver deux fois dans du P-B-S-B-T et une fois dans du PBS contenant 0,1 % de BSA, cinq minutes par lavage.

Ensuite, ajoutez aux cellules un millilitre de PBS contenant 0,1 % de BSA et l'anticorps secondaire marqué par un fluorochrome approprié à une concentration finale de 0,5 microgramme par millilitre. Incubez pendant 40 minutes en agitant à température ambiante et à l'abri de la lumière. Enfin, lavez avec du PBS pendant cinq minutes.

Séchez le puits par aspiration et maintenez les plaques à l’envers pendant une heure supplémentaire, voire toute la nuit, afin d’obtenir un séchage complet. Recouvrez les cellules avec des lamelles montées en utilisant une solution de montage Flora G. Conservez les plaques à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière jusqu’au moment du comptage. Les cellules dont les noyaux sont en apoptose, ayant subi les différents traitements décrits dans le protocole, ont été fixées et colorées avec des anticorps spécifiques E four ou four et du DPI afin de visualiser les noyaux des cellules transfectées.

Cette figure montre un exemple de cellules exprimant E four or four et GFP. Le panneau A illustre l'expression du protéine GFP témoin seule, et le panneau B montre l'expression de E four or four. Les noyaux marqués par la coloration DAPI sont présentés dans le panneau C, et les images fusionnées apparaissent dans le panneau D. Les flèches blanches indiquent les cellules transfectées exprimant GFP et E.Four or four contenant des noyaux présentant une morphologie apoptotique. Les flèches rouges marquent les noyaux ayant des formes irrégulières qui ne sont pas comptabilisés comme noyaux apoptotiques. L'astérisque marque les noyaux mitotiques ou les noyaux venant de se diviser. Le nombre de noyaux condensés ou fragmentés visualisés par la coloration DAPI a été compté afin de calculer le pourcentage de noyaux présentant une morphologie apoptotique au sein de la population de cellules transfectées, afin de préserver une objectivité optimale du test.

Le décompte des noyaux apoptotiques dans les différents échantillons a été effectué de manière aveugle, la personne effectuant le décompte n'étant pas informée de l'identité des échantillons. Un résultat représentatif est présenté dans ce graphique. Des pourcentages plus élevés d'anomalies nucléaires ont été observés dans les cellules exprimant E quatre ou quatre, confirmant que T quatre ou quatre induit la mort cellulaire. Le pourcentage le plus élevé d'anomalies nucléaires a été observé dans les cellules exprimant E quatre ou quatre lorsque les niveaux de ACF un ont été réduits par une inhibition médiée par SHR et a, indiquant que la diminution de ACF un amplifie la mort cellulaire induite par E quatre ou quatre et augmente la toxicité de E quatre ou quatre dans les cellules.

Le fait d'exprimer de faibles niveaux d'ACF n'était pas dû à une augmentation des niveaux d'E quatre ou de quatre, comme observé sur le Western blot. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de faciliter un décompte conseillé des noyaux apoptotiques à l'aide de DPI et d'appliquer des critères stricts pour l'identification de ces noyaux. En complément de cette procédure, d'autres méthodes telles que les essais clonogéniques peuvent être réalisées afin de valider les résultats de l'essai DA pse après cette procédure.

D'autres méthodes, comme les dosages de co-immunoprécipitation, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, s'il existe une interaction physique entre les protéines étudiées.