La migration des cellules dendritiques de surveillance utilisant l'imagerie par résonance 19F / 1H magnétique

L’objectif général de l’expérience suivante est de visualiser la migration des cellules dendritiques dans le ganglion lymphatique drainant à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique au fluor non invasive ou IRM en combinaison avec l’IRM conventionnelle des protons. Ceci est réalisé en préparant d’abord des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse murine et en marquant les cellules entièrement différenciées avec des particules riches en fluor. Au cours de la deuxième étape, les cellules marquées au fluor sont administrées par voie intracutanée dans les membres postérieurs d’une souris, assurant ainsi la transmigration efficace des cellules administrées.

Ensuite, la région anatomique d’intérêt est imagée par IRM au fluor et à protons, afin de surveiller la migration des cellules dendritiques de la peau vers les ganglions lymphatiques drainants. En fin de compte, la migration des cellules dendritiques de la zone d’application vers le ganglion lymphatique drainant peut être visualisée par IRM au fluor. Le principal avantage de cette méthode par rapport à d’autres techniques de suivi cellulaire telles que celles nécessitant des nanoparticules d’oxyde de fer, est que les revêtements de sol liés au carbone sont pratiquement absents de tous les organismes vivants.

Cela permet d’obtenir des images complètes sans arrière-plan et une sélectivité cellulaire complète après l’application de cellules marquées au fluor in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de l’immunologie, telles que l’influence des candidats moléculaires dans la migration des cellules dendritiques in vivo. La démonstration de la méthode est faite par Yulia Kovski, technicienne, et Helma VIIs, une scientifique senior de mon laboratoire, au 10e jour de la culture de cellules dendritiques de moelle osseuse.

Activez les cellules dendritiques avec du LPS pendant 24 heures. Marquez les cellules dendritiques avec un fluor millimolaire riche par couronne fluoro 15 cinq particules d’éther pendant ce temps également, pour confirmer que les cellules dendritiques ont été marquées avec succès, vérifiez les caractéristiques physico-chimiques des cellules à l’aide de la cytométrie en flux. Les cellules marquées au fluor sont représentées ici par des événements rouges sur le nuage de points vers l’avant et vers l’arrière et les cellules non marquées sont représentées par des événements bleus.

Position suivante, une souris C 57 black six dans un support, puis chargez une seringue à tuberculine de 0,5 millilitre avec une aiguille de calibre 26 et demi avec des cellules dendritiques marquées par fluorescence dans un volume de 50 à 100 microlitres. Maintenant, insérez soigneusement l’aiguille dans les couches supérieures de la peau de chacun des membres postérieurs de l’animal pour administrer les cellules. Après avoir anesthésié la souris, positionnez l’animal couché sur le lit de souris du scanner IRM pour petits animaux.

Après avoir fixé l’animal sur le support d’imagerie et les connexions au système de surveillance, déplacez le support au centre de la bobine RF proton-fluor pour confirmer le bon positionnement de l’animal et du scanner. Et planification ultérieure de la géométrie de la tranche d’image. Acquérez des images de reconnaissance dans trois orientations standard à l’aide de méthodes d’acquisition d’images rapides et à faible résolution dans le logiciel MR Scanner.

Réglez la bobine RF sur la fréquence de résonance du proton et sur la fréquence de résonance du fluor. Utilisez le moniteur de réglage de l’animal MR Scanner pour faire correspondre l’impédance caractéristique de la bobine à 50 ohms. Ensuite, réglez les paramètres automatiques nécessaires du système, y compris le calage pour affiner l’homogénéité du système de champ magnétique, les ajustements de fréquence pour régler la RF à la fréquence LA spécifique du système MR pour les protons et le gain de référence.

Pour ajuster l’amplitude RF, configurez un protocole 3D turbo rare pour le balayage des protons, en utilisant un TR de 1500 millisecondes et un TE de 53 millisecondes, une matrice de 400 par 200 par 200 et un facteur rare de 16. Ajustez le champ de vision à l’aide des images de repérage. Lancez ensuite l’analyse.

Chargez une séquence FID à impulsion unique avec un TR d’au moins 1000 millisecondes, puis ouvrez le balayage d’édition et réglez le noyau sur fluor dans la méthode d’édition de la boîte à outils. Désélectionnez le gain de référence automatique à l’aide de la configuration go. Démarrez la mesure sans enregistrer les données pour afficher un signal MR en temps réel.

Ajustez la fréquence de base pour centrer le pic spectral de fluor à zéro hertz dans la fenêtre d’acquisition. Sélectionnez ensuite, appliquez la fréquence de base et appuyez sur arrêter maintenant. Clonez le protocole 3D turbo rare à partir du balayage de protons précédent.

Allez à la méthode d’édition, puis désélectionnez le gain de référence automatique comme indiqué dans l’édition du balayage. Réglez le noyau de fluor, puis changez la matrice à 1 28 par 64 par 64 et le facteur rare à au moins 40. Une fois les balayages terminés, retirez le support de souris du scanner IRM et utilisez le menu d’affichage pour superposer les images de fluor aux images de protons.

Après avoir sacrifié la souris, retirez le ganglion lymphatique popal d’intérêt et placez-le dans un tube RMN de cinq millimètres contenant 100 microlitres de PFA à 2 %. Ensuite, placez le tube à l’intérieur d’une bobine de spectroscopie au fluor et déplacez la bobine dans le centre ISO de l’aimant. Réglez la bobine RF sur la fréquence de résonance du fluor, puis sur le moniteur de réglage du scanner MR animal, faites correspondre l’impédance caractéristique de la bobine à 50 ohms dans la boîte à outils de calage.

Réglez tous les paramètres de cale à zéro et appuyez sur Appliquer. Chargez ensuite une séquence FID à impulsion unique avec un TR d’au moins 1000 millisecondes. Ouvrez, modifiez, numérisez et réglez le noyau sur fluor.

Maintenant, à l’aide de go setup, démarrez la séquence, ajustez la fréquence de base de sorte que le pic spectral de fluor soit au centre de la fenêtre d’acquisition à zéro hertz et appliquez la fréquence de base. Ajustez ensuite à nouveau l’atténuateur d’impulsions pour maximiser le signal afin d’atteindre une excitation de 90 degrés. Lorsque le signal est au maximum, appuyez sur stop.

Enfin, dans la méthode d’édition, réglez les moyennes entre 64 et 256 en fonction du signal, puis utilisez go pipeline. Débuter l’acquisition 18 à 21 heures après l’application intra cutanée. Les cellules dendritiques marquées au fluor migrent dans le ganglion lymphatique popal drainant.

Le mouvement des cellules dendritiques via les canaux lymphatiques dans le ganglion lymphatique public drainant peut être apprécié en superposant les images anatomiques des protons avec les cellules dendritiques fluorées. Sur les images, les cellules dendritiques sont représentées par un MR de fluor. Signal en rouge, tandis que les ganglions lymphatiques et les canaux lymphatiques sont représentés dans l’image IRM anatomique du proton en échelle de gris. Afin de quantifier l’étendue de la migration des cellules dendritiques dans les ganglions lymphatiques drainants, les ganglions lymphatiques sont extraits et une IRM au fluor est effectuée comme cela vient de être démontré lorsque le signal fluoré obtenu de chaque ganglion lymphatique est comparé au signal fluoré obtenu à partir de différents nombres de cellules dendritiques marquées avec par couronne fluoro 15 cinq particules d’éther comme illustré par cette courbe d’étalonnage, Le nombre de cellules dendritiques marquées au fluor qui atteignent le ganglion lymphatique drainant peut être déduit pour cette expérience représentative.

On peut estimer que 7,5 fois 10 cellules dendritiques à la quatrième puissance qui n’étaient pas chargées d’antigène ont atteint le ganglion lymphatique gauche, tandis que 3,6 fois 10 à la cinquième cellule dendritique chargée d’antigène atteignent le ganglion lymphatique droit. Bien que cela puisse donner un aperçu des mécanismes moléculaires de la migration des cellules immunitaires dans des conditions normales, il peut également être utilisé dans des modèles animaux tels que ceux des maladies auto-immunes. De plus, les implications de cette technique s’étendent au domaine de la thérapie du cancer.

Toute cible moléculaire identifiée peut être utilisée pour manipuler les cellules dendritiques pour le traitement des tumeurs.