Trypsine protocole Digest pour analyser la vascularisation rétinienne d'un modèle de souris

L’objectif global de cette procédure est d’isoler le réseau vasculaire rétinien. Ceci est accompli en effectuant d’abord une série de lavages à l’eau sur la rétine isolée. Dans la deuxième étape, la rétine est digérée dans de la trypsine à 37 degrés Celsius pendant environ une heure à une heure et demie, selon la taille de la rétine.

Ensuite, le système vasculaire est isolé par des lavages à l’eau supplémentaires et une dissection au microscope. En fin de compte, les changements vasculaires pathologiques tels que les micro-anévrismes, la dégénérescence capillaire et le rapport anormal entre les cellules endothéliales et les parasites peuvent être visualisés. Ainsi, le principal avantage d’essayer et de digérer par rapport aux méthodes existantes comme la préparation de montages plats rétiniens est que l’ensemble du réseau vasculaire peut être mis en évidence avec une grande clarté.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car elle est techniquement difficile et difficile à exécuter de manière constante. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’isolement vasculaire sont difficiles à apprendre par des mots seuls. Il s’agit d’un outil très précieux dans tout laboratoire qui effectue des études de biologie vasculaire rétinienne telles que certaines maladies telles que la rétinopathie diabétique, la démonstration de cette technique sera par Jonathan Chow, un étudiant en médecine talentueux de mon laboratoire.

Après avoir fixé l’œil de souris énucléé et la formine tamponnée à 10 % de neutre pendant 24 heures, placez l’œil dans une boîte de Pétri et couvrez-le d’une petite quantité d’eau. Commencez la dissection en utilisant une paire de ciseaux de dissection pour faire soigneusement une première incision dans la cornée. Ensuite, tout en tenant la zone coupée avec une pince droite, utilisez une paire de ciseaux pour couper le long du bord de la cornée et de la sclérotique en enlevant la cornée.

Ensuite, utilisez des pinces fines, incurvées et droites. Pour décoller lentement et soigneusement la sclérotique et la choroïde de la rétine vers le nerf optique. Retirez ensuite le cristallin et tout excès d’iris et de débris de la rétine pour aider à séparer les couches rétiniennes neurales des vaisseaux sanguins.

À environ 500 microlitres de 45 micromètres, filtrez l’eau dans une plaque à 24 puits et placez la rétine dans un puits, puis agitez doucement pendant quatre à cinq heures à température ambiante, en changeant l’eau toutes les 30 à 60 minutes. Continuez à laver la rétine à l’eau pendant la nuit en secouant doucement à température ambiante le lendemain, retirez l’eau et, à 3 % de trypsine, vérifiez au microscope qu’aucun débris n’est trouvé dans le puits. Pour éviter que le système vasculaire n’y adhère, incubez le tissu à 37 degrés Celsius en secouant doucement ou sans le faire pendant une heure à une heure et demie.

Lorsque le tissu commence à montrer des signes de désintégration, placez la plaque sur la platine du microscope, puis évitez la rétine. Retirez soigneusement la trypsine pour séparer le système vasculaire. Tout d’abord, ajoutez de l’eau filtrée dans la rétine à l’aide d’une pince

Décollez la membrane limitante interne, qui apparaît sous la forme d’une fine couche transparente. Agitez légèrement la plaque. Après cinq minutes, placez à nouveau la plaque sur la platine du microscope et remplacez soigneusement l’eau, en évitant d’endommager la rétine pour aider à libérer le réseau de vaisseaux du tissu rétinien adhérent.

Lavez la rétine comme nous venons de le démontrer jusqu’à ce qu’il reste peu ou pas de débris dans l’eau après le dernier lavage. Donc, généralement, l’ablation de tout le tissu non vasculaire est la partie la plus délicate de la procédure. Les techniques suivantes peuvent être utilisées soit en séquence, soit individuellement Pour faciliter l’isolement du réseau vasculaire, un conseil important est de tremper tous les outils et la trypsine avant de manipuler la rétine.

Cela peut aider à éviter qu’un tissu n’adhère à l’équipement. Enduisez une pointe de micro-pipette de 200 microlitres avec de la trypsine réservée, puis pipetez soigneusement l’eau de haut en bas, à côté des vaisseaux rétiniens et en soufflant vers eux, provoquant une légère agitation. Si le tissu non vasculaire est toujours résistant au centre, une micro-pipette enrobée de trypsine pointe au niveau du nerf optique et pipette soigneusement l’ensemble du réseau de vaisseaux de haut en bas pour aider à décomposer le tissu non vasculaire.

Enfin, très bien. Les pinces peuvent être utilisées pour soulever doucement le système vasculaire hors de l’eau afin de déloger tous les composants non vasculaires d’adhérence. Le résultat final devrait être un réseau vasculaire rétinien intact et exempt de débris.

Pour visualiser le système vasculaire, placez d’abord une goutte d’eau sur une lame propre. Transférez ensuite les récipients digérés dans l’eau sous un contrôle de l’endoscope. Si le support de volet des VA est plié ou déplié, les récipients pliés entraînent une mauvaise visibilité.

Une fois taché, si le tissu est plié, ajoutez de l’eau supplémentaire et secouez doucement la lame pour faciliter le dépliage. Ensuite, utilisez une micro-pipette pour éliminer lentement tout excès d’eau. Le produit final d’une procédure réussie est un montage plat de l’ensemble du réseau vasculaire rétinien de souris avec l’architecture maintenue et colorée à l’hémat, à la toïne et à l’éoïne.

Comme on le voit ici, comme on le voit sur cette image, une différenciation claire entre les cellules endothéliales et les péricytes peut être observée dans la rétine. Les noyaux des cellules endothéliales, comme l’indique la flèche blanche, sont ovales ou allongés et se trouvent entièrement à l’intérieur de la paroi du vaisseau. Les noyaux du parasite sont indiqués par la flèche noire sont petits, sphériques densément colorés et ont généralement une position protubérante le long de la paroi capillaire.

La trypsine et la digestion sont une procédure couramment utilisée pour analyser la pathologie vasculaire dans les modèles animaux diabétiques. Cette image montre un exemple de dégénérescence capillaire telle qu’indiquée par la flèche blanche observée chez une souris DB DB, un modèle de diabète de type 2. Bien que cette procédure ait été optimisée pour les rétines de souris, des résultats similaires peuvent également être obtenus dans les rétines de rat.

Il est important de noter que les rétines de rat, comme le montrent ces images, sont plus grandes que les rétines de souris et nécessitent 12 plaques au lieu de 24. Le réseau vasculaire de la rétine du rat est également moins fragile que celui de son homologue de souris. Il est extrêmement crucial d’enlever autant de tissu non vasculaire que possible.

Tout résidu entraînera une coloration non spécifique et entraînera une mauvaise visualisation du système vasculaire. Sur cette image, par exemple, on peut observer l’ablation infructueuse de tout le tissu non vasculaire. De même, il est également important de faire déplier la rétine lors du montage afin d’améliorer la visualisation du système vasculaire.

Cette image montre un dépliage infructueux de la monture plate vasculaire. Après avoir maîtrisé cette procédure techniquement difficile. Les voyages et les digestions peuvent être une méthode extrêmement précieuse qui permet une visualisation détaillée de l’ensemble du réseau vasculaire

En améliorant cette technique dans l’œil de la souris, les chercheurs peuvent tirer parti des souris génétiquement manipulées pour étudier diverses voies qui peuvent prendre le contrôle du système vasculaire rétinien et nous permettre de comprendre la physiopathologie de diverses maladies rétiniennes. Grâce à cela, nous pouvons améliorer notre compréhension des pathologies pathologiques telles que la rétinopathie diabétique. En étudiant des modèles de souris comme la souris DVDB, cela peut finalement permettre de trouver de nouvelles interventions thérapeutiques potentielles ciblant le système vasculaire rétinien.