Protein Purification méthode sans la détermination de l'affinité de liaison par thermophorèse Microscale

L’objectif global de cette procédure est de déterminer l’affinité de liaison de l’interaction d’un ligand protéique sans purifier la protéine d’un lysat cellulaire. Ceci est accompli en exprimant d’abord la protéine fusionnée GFP d’intérêt dans toute lignée cellulaire adhérente. Après la préparation du lysat cellulaire et des dilutions de ligands, des mélanges de ligands de lysat cellulaire sont préparés et chargés dans des capillaires.

Ensuite, la thermorésis de la protéine fusionnée à la GFP en présence de concentrations variables de ligands est mesurée. La dernière étape est l’analyse des données des mesures de thermophérèse à l’échelle microscopique ou MST. En fin de compte, la thermorésis à l’échelle microscopique est utilisée pour déterminer les affinités de liaison des interactions entre les protéines fusionnées à la GFP et divers ligands.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le titrage, la calorimétrie ou la monothérapie plasmatique de surface, est qu’elle évite la purification des protéines, simplifiant et accélérant considérablement la caractérisation quantitative des interactions binaires. Cette méthode présente des avantages non négligeables lorsqu’il s’agit de travailler avec des protéines difficiles à exprimer et à purifier, telles que les protéines membranaires et les facteurs de transcription. L’un des plus grands avantages de la thermophérèse à l’échelle microscopique est qu’elle fonctionne dans une variété de tampons et tolère la présence de détergents et de mes cellules dans le système Karen Stefka, une biologiste de mon laboratoire. Karen Stefka, biologiste de mon laboratoire, fera la démonstration de la technique pour commencer à laver brièvement les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate glacée ou PBS en utilisant 10 millilitres de tampon par flacon T 75.

Gardez les cellules sur de la glace pendant cinq minutes ou jusqu’à ce qu’elles commencent à se détacher du flacon. Grattez les cellules avec le grattoir de cellules pour les détacher si nécessaire. Suspendez à nouveau les cellules dans 10 millilitres de PBS glacé et transférez-les dans un tube à centrifuger à fond rond pré-refroidi de 14 millilitres.

Granulez les cellules par centrifugation à 400 à 600 Gs et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de tampon de lyse glacée. Transférez la suspension dans un tube einor pré-refroidi de 1,5 millilitre pour l’extraction des protéines cytosoliques.

Placez les cellules sur de la glace pour minimiser la surchauffe locale et appliquez trois fois des impulsions de sonication de dix secondes à 30 % d’amplitude. À l’aide d’un embout de pré-refroidissement de deux à trois millimètres, maintenez l’embout sous la surface pour minimiser la mousse. Omettez cette étape lorsque vous utilisez un détergent contenant un tampon et incubez sur de la glace pendant 30 minutes.

Au lieu de cela, corrigez la solution de lysat pour qu’elle contienne une concentration physiologique de sel de 100 millimolaires de chlorure de sodium si nécessaire à partir d’une solution mère de chlorure de sodium de cinq molaires. Enfin, collectez les lysats par centrifugation à environ 25 000 G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Sélectionnez la diode électroluminescente ou la source d’excitation LED de longueur d’onde égale à 470 nanomètres sur l’instrument MST.

Chargez les capillaires avec de l’extrait cellulaire dilué deux et 10 fois avec du tampon MST et placez-les dans l’instrument MST. Effectuez l’opération de recherche de capillaires sur le logiciel de contrôle de l’instrument MST. La plage de fluorescence optimale dans le lysat dilué est de 400 à 1500 unités de fluorescence.

Procédez à la détermination de la plage de concentration optimale des ligands comme décrit dans le protocole de texte. Placez un support de tubes avec le nombre nécessaire de tubes à centrifuger à faible liaison de 0,5 millilitre sur une pipette à glace, 25 microlitres de tampon MST au fond de chaque tube à 25 microlitres de la solution mère de ligand dans le premier tube et effectuez une double dilution en série du ligand en utilisant le reste des tubes. Gardez le support avec les échantillons de ligand sur de la glace.

Calculez la dilution du lysat cellulaire pour obtenir le niveau optimal de la protéine cible fluorescente dans les réactions de liaison. La concentration finale en protéines doit être proche ou inférieure de la constante de dissociation de liaison attendue, et doit être ajustée pour obtenir le nombre nécessaire de comptages de fluorescence. Dans la solution finale, procédez à la dilution du lysat cellulaire avec le tampon MST.

Placez des tubes à faible liaison de 0,5 millilitre dans le rack de tubes en face des tubes contenant des échantillons de dilution en série de ligands. Ajoutez soigneusement 15 microlitres de lysat cellulaire au fond de chaque tube. Essayez de ne pas toucher les parois du tube pour éviter la perte d’échantillon.

Ajoutez 15 microlitres de l’échantillon de ligand avec la concentration la plus élevée dans le tube correspondant. Premièrement, avec le lysat cellulaire. Mélangez bien et changez l’embout de la pipette.

Répétez cette étape avec le reste des tubes à l’exception du dernier, qui ne doit contenir aucun ligand. Ajoutez 15 microlitres de tampon MST dans le dernier tube et mélangez. Remplissez bien environ les deux tiers du premier capillaire avec le mélange de liaison du tube numéro un.

Inclinez-le pour déplacer la solution vers le centre et placez le capillaire sur le plateau capillaire jusqu’à la position. Premièrement, répétez cette étape avec le reste des capillaires. Les extrémités capillaires peuvent être bouchées avec de la cire pour des expériences plus longues.

Placez le plateau à l’intérieur de l’instrument MST et fermez la porte de l’instrument. Ensuite, sélectionnez la source d’excitation LED avec une longueur d’onde égale à 470 nanomètres. Sur l’instrument MST, exécutez la commande find capillaries pour permettre à l’instrument de trouver les positions exactes des capillaires et de mesurer la fluorescence des échantillons en fonction de l’intensité du signal fluorescent.

Ajustez la puissance de la LED pour l’amener dans l’intervalle de 400 à 1500 unités. Cliquez sur le bouton de démarrage pour effectuer l’expérience Thermo Resis. Plus d’une puissance laser infrarouge peut être choisie pour l’expérience.

Afin de trouver le gradient de température optimal pour un système particulier, il faut 10 à 12 minutes pour faire fonctionner un ensemble de 16 capillaires. Collectez les données de deux à trois cycles pour le même ensemble de capillaires afin d’assurer la reproductibilité des mesures. Pour commencer l’analyse des données, ouvrez le logiciel d’analyse et chargez le dossier du projet.

Dans l’information qui apparaît, exécutez la visionneuse de sélection collectée à une puissance laser IR spécifique courbes thermo-rétiques. Il était possible d’ouvrir toutes les traces thermorétiques collectées dans diverses conditions à la fois, puis de choisir les courbes à analyser en les activant et en les désactivant. Dans la fenêtre du graphique des points d’évaluation, sélectionnez la thermo-résine ou la thermophérèse avec des lignes bleues et rouges de saut T.

Définissez deux régions des courbes expérimentales qui sont sélectionnées manuellement pour l’analyse par le logiciel. Assurez-vous que les lignes bleues et rouges sont correctement positionnées pour permettre le changement maximal de Thermo Resis. Pour obtenir les points moyennés avec des écarts-types, sélectionnez Utiliser la moyenne ou distinguer les exécutions pour des exécutions distinctes.

Pour tracer un ajustement de constante de dissociation, sélectionnez Utiliser la moyenne, entrez et fixez la valeur de concentration de la molécule étiquetée et ajustez la courbe. La constante de dissociation de liaison ou la valeur KD avec son écart-type apparaît dans une fenêtre contextuelle d’informations distincte. Enregistrez les données d’ajustement moyen dans un fichier texte et transférez-les vers Excel.Heck.

2 9 3 cellules exprimant STAT 3G FP ont été utilisées comme source de stat trois marquée par fluorescence. Pour un test de liaison à l’ADN, la liaison d’oligonucléotides hautement chargés a entraîné des changements significatifs dans la mobilité de STAT. Dans le gradient de température.

Le signal thermorétique est tracé en fonction de la concentration en oligonucléotides. Chaque point de données représente la moyenne de trois mesures. Un logiciel d’analyse nano-temporelle a été utilisé pour ajuster et déterminer les valeurs apparentes de KD.

Les constantes de dissociation apparentes étaient de 37,9 plus ou moins 1,0 micromolaire pour la liaison au motif gazeux, et de 23,3 plus ou moins 0,6 micromolaire pour la liaison aux oligonucléotides riches en acides plus 100. Étonnamment, les séquences plus 100 ont montré une liaison légèrement plus serrée que le gaz. En trois répétitions de mesures, la substitution de A à G a entraîné une diminution spectaculaire de l’affinité du mutant s plus 100.

Alors que le s plus 100 mutant deux n’a montré aucune liaison détectable, confirmant ainsi la liaison sélective de la séquence de STAT trois à s plus 100 Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les conditions optimales pour l’extraction des protéines membranaires diffèrent selon les protéines et nécessitent généralement une optimisation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer une affinité de liaison d’une protéine à un élégant sans purifier la protéine de la cellule. Lysat.