Isolement des hépatocytes humains par un deux-étape collagénase procédure de perfusion

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les hépatocytes humains à l’aide d’une procédure de perfusion de collagénase en deux étapes. Ceci est accompli en canulant d’abord les vaisseaux sanguins d’un morceau de foie avec une canule d’irrigation. S’ensuit la perfusion et la digestion du morceau de foie à l’aide de la collagénase.

La troisième étape est l’ablation de la capsule glistens, qui libère les cellules hépatiques dissociées. La dernière étape est une centrifugation à basse vitesse qui isole les hépatocytes. En fin de compte, les hépatocytes peuvent être identifiés par microscopie à contraste de phase ou par coloration à l’albumine à l’aide de l’immuno-chimie avec une viabilité et un rendement des hépatocytes déterminés à l’aide d’un test d’exclusion du bleu triam.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de canulation et de digestion sont difficiles à apprendre. En effet, la canulation nécessite une certaine finesse et l’achèvement de la digestion peut être difficile à identifier. Pour les personnes novices dans la technique, la démonstration de la procédure sera assurée par Natalie Lun, une technicienne de mon laboratoire.

Dans cette démonstration, nous utiliserons un morceau de foie de lampe à la place d’un morceau d’un humain, Installez l’équipement pour la perfusion du morceau de foie comme suit, réglez le bain-marie à une température appropriée de sorte que les solutions soient à 37 degrés Celsius lorsqu’elles atteignent le foie. Morceau. 41 degrés Celsius sont bons pour les solutions un, deux et trois, et pour le condenseur en verre gainé, la solution quatre, cependant, devrait être à 37 degrés Celsius pour réduire la perte d’activité de la collagénase. Peu de temps avant la profusion, allumez le régulateur de gaz Pour l’appareil d’oxygénation auprès d’un pathologiste, procurez-vous un morceau de foie qui a idéalement une capsule de glistens presque intacte ou entièrement intacte et un seul endroit de surface coupée.

Ce morceau de foie sur l’entonnoir de Buchner qui contient un disque filtrant perforé, le système de perfusion doit maintenant être amorcé avec la première solution à l’aide d’une canule d’irrigation incurvée à insert à faible débit avec des pointes d’olive dans les plus gros vaisseaux sanguins sur la surface coupée du morceau de foie. Au fur et à mesure que le sang s’écoule du foie, le tissu s’allège dans les zones où la perfusion est bonne. Le nombre de canules utilisées varie pour des foies de différentes tailles.

En général, quatre à huit canules doivent être utilisées pour des foies allant de moins de 20 grammes à plus de 80 grammes. Sélectionnez la jauge de la canule pour avoir un ajustement parfait et sûr. Laissez les petits vaisseaux sanguins ouverts pour que le tampon s’écoule du tissu.

Maintenant, augmentez le débit de la pompe péristaltique entre 110 et 460 millilitres par minute. C’est une bonne perfusion si le morceau de foie est d’une couleur plus claire tout au long du débit utilisé. Dépend de la taille du foie, les taux de perfusion étant plus élevés utilisés pour les foies plus gros.

D’une manière générale, une vitesse de perfusion moyenne de 44 millilitres par minute et par canule est idéale pour une gamme de poids hépatiques différents. Le débit choisi doit entraîner un léger repulpage du morceau de foie. Gardez le morceau de foie humide pendant la perfusion en le recouvrant d’un morceau de gaze imbibé de solution saline.

Après avoir perfusé le tissu avec un litre de solution, une pour évacuer le sang restant dans le morceau de foie. Changez le liquide de perfusion dans la solution deux et perfuser pendant 10 minutes. Ensuite, passez le liquide de perfusion à la solution trois et perfuser avec un demi-litre.

Changez maintenant le liquide de perfusion en solution quatre, qui contient de la collagénase. Effectuez cette perfusion en recirculation pendant neuf à 12 minutes ou jusqu’à ce que le foie soit suffisamment digéré. Le tissu hépatique doit sembler se briser légèrement sous la capsule scintillante.

Le foie doit également se sentir ramolli lorsqu’il est sondé avec le côté émoussé d’un scalpel. Il est important de digérer le morceau de foie pendant la bonne durée, car une digestion excessive peut entraîner une faible viabilité des hépatocytes et une digestion insuffisante peut entraîner un faible rendement des hépatocytes. Commencez par éteindre la pompe péristaltique et retirer la canule du morceau de foie.

Placez ensuite le tissu dans un plat de cristallisation contenant 100 à 200 millilitres de solution. Cinq. Retirez délicatement la capsule de glistens et secouez doucement les cellules. S’il y a des régions qui ne sont pas bien irriguées, un scalpel peut être utilisé pour couper à travers ces régions afin de libérer les cellules qu’elles contiennent.

Ajoutez plus de solution cinq au besoin au cours du processus et, finalement, amenez le volume de la solution cinq à 500 millilitres. Filtrez maintenant la suspension cellulaire deux fois. Tout d’abord, filtrez les cellules à travers un maillage en nylon de 210 microns dans une fiole conique d’un litre.

Ensuite, filtrez les cellules à travers un maillage en nylon de 70 microns dans une fiole conique d’un litre. Versez deux volumes égaux de suspension cellulaire dans des tubes à centrifuger de 200 millilitres. Ensuite, centrifugez la suspension de cellules filtrées à 72 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Aspirez le snat et remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans environ 200 millilitres de solution. Cinq. Répétez la centrifugation et la suspension réanimation trois fois après la centrifugation finale, remettez les cellules en suspension dans une solution de stockage frigorifique pour une concentration finale de deux à 5 millions d’hépatocytes par millilitre. Un test triam blue peut être utilisé pour mesurer avec précision le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

On voit ici des hépatocytes colorés en bleu trian provenant de 648 isolements. La viabilité moyenne des hépatocytes humains isolés était de 77 plus ou moins 10 %Le rendement moyen d’hépatocytes était de 13 plus ou moins 11 millions d’hépatocytes par gramme de foie au moyen de l’immunofluorescence. Les hépatocytes isolés qui se coloraient positivement pour l’albumine en vert avaient une pureté de 94 plus ou moins 1 % pour déterminer la pureté des hépatocytes.

La coloration immunofluorescente a été réalisée quatre fois avec cinq répétitions par essai. La microscopie à contraste de phase montre les caractéristiques morphologiques des hépatocytes, telles que la grande taille de leurs cellules et leur forme polygonale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les hépatocytes humains à l’aide d’une procédure de perfusion de collagénase en deux étapes.