Quantification de la réponse du Rafale respiratoire comme indicateur d'Innate Immune Health chez le poisson zèbre

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser la fluorescence pour quantifier la réponse respiratoire. Tout d’abord, chargez les embryons de poisson-zèbre dans les puits d’une plaque de 96 puits. Ajoutez ensuite un substrat fluorescent et activez l’explosion respiratoire avec un agent chimique.

Quantifiez ensuite la fluorescence relative à l’aide d’un fluorimètre. En fin de compte, la fluorescence est utilisée pour montrer le potentiel d’explosion respiratoire. Cette méthode peut être utilisée pour étudier comment les manipulations expérimentales affectent la santé immunitaire innée globale.

Ici, nous l’utilisons pour donner un aperçu de l’explosion respiratoire des embryons de poisson-zèbre, mais il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que le poisson-zèbre adulte, les cellules rénales et les préparations cellulaires d’autres espèces de poissons. Faites pousser les embryons dans des boîtes de Pétri profondes à 28 degrés Celsius dans de l’eau d’œuf jusqu’au stade de développement souhaité. Retirez tous les embryons morts tous les jours.

Décantez soigneusement l’eau de l’ancien œuf et remplissez-la quotidiennement d’eau de nouvel œuf. Le jour de l’expérience, préparez une solution de travail à fluorescéine réduite dans un tube à centrifuger de 1,7 millilitre enveloppé d’une feuille d’aluminium. Préparez également une solution de travail de 20 microgrammes par millilitre de concentration finale de PMA.

Préparez ensuite cinq millilitres de chaque solution de dosage dans des tubes coniques de 15 millilitres comme décrit dans le texte d’accompagnement. Gardez les solutions de dosage sur la glace en premier, allumez le lecteur de microplaques et réchauffez la source lumineuse pour mesurer la fluorescence. Mettez en place un programme détaillant les longueurs d’onde d’excitation et d’émission, la sensibilité de position de l’optique, et incluez également une étape d’agitation de cinq secondes.

Avant le roseau, organisez les approvisionnements expérimentaux de boîtes avec des embryons enrobés. Une microplaque noire de 96 puits, une pipette P 200 et des pointes dans un seau à glace contenant de la fluorescéine contenant des réactifs. Une pipette multicanaux P 200, deux réservoirs stériles, une feuille d’aluminium et des ciseaux.

Coupez maintenant une pointe de pipette de manière à ce que les embryons ou les reins puissent passer par l’ouverture. Réglez une pipette P 200 à 100 microlitres et transférez un embryon avec de l’eau d’œuf dans autant de puits d’une microplaque noire à 96 puits que vous le souhaitez. Versez maintenant la solution de dosage dans un réservoir stérile de 25 millilitres avec une pipette multicanaux P 200.

Ajoutez 100 microlitres de solution de dosage H 2D CFDA dans une colonne de 96. Eh bien, répétez la microplaque pour la moitié des échantillons d’embryons témoins et la moitié des échantillons d’embryons manipulés expérimentalement. Versez la solution doseuse contenant le PMA dans un nouveau réservoir stérile de 25 millilitres.

Ensuite, aliquote cette solution de dosage dans les colonnes restantes de la microplaque à 96 puits. Couvrez la microplaque de papier d’aluminium et placez-la sur un shaker pendant environ 20 secondes. À 150 tr/min, incubez la microplaque à 28 degrés Celsius lorsqu’elle n’est pas lue.

Lire la microplaque après l’ajout de PMA. Continuez à prendre des mesures toutes les quelques minutes pendant l’intervalle de temps souhaité, ou incubez la microplaque enveloppée d’aluminium à 28 degrés Celsius jusqu’à un point temporel fixe. Ensuite, récupérez les embryons dans les puits et euthanasiez les embryons selon le protocole institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.

Jetez également la microplaque et les autres matériaux jetables dans le peintre de déchets biologiques. Décidez du moment où vous souhaitez comparer la fluorescence. Soustrayez la valeur moyenne de fluorescence du groupe témoin non induit des valeurs de fluorescence grippale du groupe témoin induit par PMA.

Répétez cette opération pour le groupe expérimental avec et sans PMA. Stockez ensuite ces valeurs de fluorescence normalisées dans des colonnes, le groupe témoin plus PMA et le groupe expérimental plus PMA. Ensuite, calculez les moyennes et les écarts-types des valeurs de fluorescence normalisées du groupe témoin plus PMA et du groupe expérimental plus PMA.

Comparez les valeurs de fluorescence normalisées à l’aide d’un test T non apparié pour déterminer la signification statistique. Maintenant, représentez graphiquement les moyennes du groupe témoin plus PMA et du groupe expérimental plus PMA avec des barres d’erreur reflétant les écarts-types appropriés pour enregistrer le niveau de signification sur le graphique et dans la légende de la figure. Cette expérience compare la réponse respiratoire chez des embryons de poisson-zèbre de type sauvage de fond AB à 48 heures et 72 heures après la fécondation.

La fluorescence brute a été mesurée quatre heures après l’ajout de PMA dans les groupes induits par PMA. Les valeurs de fluorescence brute étaient plus élevées dans la population de 72 HPF. Comme l’indiquent les moyennes calculées, les valeurs de fluorescence sont normalisées pour tenir compte de la variabilité des niveaux de fluorescence de fond.

Les résultats de ce test de rafale respiratoire ont révélé que les 72 embryons de poisson-zèbre HPF sont capables de produire significativement plus d’espèces réactives de l’oxygène et donc de développer une réponse respiratoire plus robuste que 48 embryons HPF après induction avec PMA. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la fluorescence pour quantifier le potentiel d’explosion respiratoire des embryons de poisson-zèbre. N’oubliez pas que travailler avec de la poudre PMA peut être extrêmement dangereux, alors prenez des précautions telles que le port d’un masque facial tout en pesant la poudre PMA.