Identification à base de microréseaux de HERV individuelle Loci Expression: Demande de Découverte de biomarqueurs dans le cancer de la prostate

Cette analyse transcriptomique de tissus cancéreux de la prostate humaine identifie les loci d’expression individuels des rétrovirus endogènes humains afin d’évaluer une puce à ADN haute densité personnalisée comme outil de criblage pour la découverte de biomarqueurs. Une fois que le chirurgien a retiré l’organe de la prostate du patient, le pathologiste prépare séparément les tissus tumoraux et normaux adjacents dans l’extraction en laboratoire, la purification et la qualification de l’IRM. Les NA des tissus normaux et tumoraux amplifient les ARNm à l’aide du kit d’ovation du transcriptome entier, puis clivent et marquent les produits amplifiés résultants. Ensuite, traitez séquentiellement la puce H-E-R-V-V deux par remplissage, hybridation, lavage et balayage.

En fin de compte, à l’aide de méthodes de bioinformatique, des ensembles de sondes présentant un signal significatif et une expression différentielle peuvent être suivis, ce qui conduit à l’identification de loci individuels transcriptionnellement actifs. Il y a de nombreuses années, nous avons exploré le comportement de la famille IRV W dans divers contextes, y compris des échantillons de sclérose en plaques. Placenta testis.

J’ai d’abord eu l’idée de sa méthode lorsque nous avons commencé à comprendre que des sous-groupes d’éléments IRV qui se chevauchaient ou non au sein d’une famille étaient exprimés. Selon le contexte. L’utilisation de la technologie du navire permet l’exploration coordonnée de plusieurs de ses familles et l’analyse simultanée de différentes régions pour chaque locus.

Par exemple, US three et le domaine UF pour LTR, qui peuvent soutenir un rôle direct dans la pathologie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, comme pour le diagnostic du cancer de la prostate, où les biomarqueurs protéiques existants comme le PSA manquent de spécificité et de sensibilité. Pendant ce temps, les ARN non codants comme le PCA trois semblent plus prometteurs, La démonstration de la procédure de manipulation de la prostate sera vendre michel un technicien du département de pathologie.

Philippe fera une démonstration de la préparation et de l’analyse de la cible d’extraction de l’ARN, tandis qu’un technicien du laboratoire John Unit fera une démonstration de la procédure du navire. Montez le parcours de tissus congelés verticalement sur un petit monticule d’OCT au niveau du cryostat. Prenez une seule coupe de cinq microns, colorez-la avec du Blu udine, puis effectuez un examen histologique rapide pour examiner la nature du tissu à la recherche de tissu tumoral.

Estimez la quantité de cellules tumorales et ne sélectionnez que des carottes contenant plus de 80 % de cellules tumorales. Coupez une autre section de cinq microns et colorez avec de l’hématine, de l’eoin et du safran. Coupez maintenant 15 sections de 30 microns d’épaisseur et transférez-les dans un tube à orph sans ARN.

Ensuite, prenez une dernière section de cinq microns pour la coloration à l’hématine, à l’eoin et au safran afin de contrôler la quantité de cellules tumorales. A la fin de la procédure, transférez les échantillons sur glace carbonique vers le laboratoire de biologie moléculaire. Homogénéiser le tissu dans une solution de Triol sur de la glace, à l’aide d’un broyeur à main jusqu’à ce que le tissu soit complètement dissous.

Incuber les échantillons à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite 300 microlitres de chloroforme et faites un vortex pendant 15 secondes. Après deux minutes à température ambiante, centrifuger à 12 000 G pendant 15 minutes à deux à huit degrés Celsius.

Pour l’ARN, transférez soigneusement la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Ajouter 750 microlitres d’isopropanol, mélanger par inversion et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Centrifugez les échantillons pour granuler l’ARN précipité, lavez la pastille d’ARN avec un millilitre d’éthanol à 80 %.

Ensuite, centrifugez les échantillons à 7 500 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant à l’aide des pointes P 1000 et P 10. Laissez l’éthanol restant sécher à l’air.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’eau libre d’ARN. Transférez les échantillons dans un bloc de chaleur à 70 degrés Celsius. Pour dissoudre la pastille, vérifiez la qualité de l’ARN et l’intégrité de l’ARN à l’aide d’un bioanalyseur et d’un NanoDrop selon les instructions du fabricant.

Dans une extraction d’ARN idéale, le nombre d’intégrité de l’ARN est généralement de sept ou plus. Continuez avec l’ensemble de l’ovation du transcriptome, kit d’amplification de l’ARN en suivant les instructions du fournisseur. Purifiez ensuite le produit CD NA simple brin obtenu.

Vérifiez le rendement et la distribution granulométrique de l’ADNC simple brin à l’aide d’un bioanalyseur et d’un NanoDrop conformément aux instructions du fabricant. La distribution de taille du CD NA amplifié doit généralement être comprise entre 101 et 500 bases avec un pic d’environ 600 bases et avoir une distribution globale en forme de cloche. Ensuite, pour fragmenter l’ADNC, ajoutez 6,6 microlitres de mélange de fragmentation à deux microgrammes de CD NA dans 30 microlitres de spin et d’incubation à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, inactivez celui de l’ADN à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes et restez sur la glace. Aliquote d’un microlitre de l’ADNC fragmenté pour la vérification de la distribution de taille basée sur Agilent. Le traitement unique de l’ADN homogénéise la distribution de la taille des CD NA à environ 100 nucléotides avant l’hybridation.

Vérifiez la distribution de la taille du CD NA à un seul brin à l’aide d’un bioanalyseur Pfizer pré-humide. La puce génétique HERV avec 200 microlitres de pré hybridation. Mélangez et incubez à 50 degrés Celsius, 60 tr/min pendant 10 minutes.

Ajoutez 131 microlitres de mélange d’hybridation aux 69 microlitres de CD NA fragmenté et étiqueté à température ambiante et dans la nature pendant deux minutes à 95 degrés Celsius. Ensuite, incubez à 50 degrés Celsius pendant cinq minutes et centrifugez à vitesse maximale pendant cinq minutes. Videz maintenant la puce génétique HERV pré-humidifiée et chargez la préparation cible de 200 microlitres.

Appliquez des points durs sur les deux hybrides SEPTA à 50 degrés Celsius, 60 tr/min pendant 18 heures. Videz la puce du gène HERV et remplissez la sonde. Être en réseau avec 250 microlitres de tampon de lavage, placer 600 microlitres de mélange de solution SAPE et 600 microlitres de mélange de solution d’anticorps aux positions numéro un et numéro deux, placer 800 microlitres de tampon de maintien en réseau en position.

Troisièmement, enfoncez les aiguilles. Attribuez la bonne puce à chaque module. Sélectionnez le protocole FS 4 5 0 0 0 0 4 et exécutez chaque module comme indiqué par le logiciel.

Appliquez des points durs sur la SEPTA pour éviter les fuites. Chargez ensuite la puce dans le chargeur automatique ou directement dans le scanner. Lancez l’analyse.

Après avoir numérisé le point de puce, les fichiers CEL sont générés, vérifiez l’image et alignez la grille à l’endroit précis pour identifier les cellules de la sonde. Soumettez également les puces à plusieurs mesures de contrôle de la qualité. Maintenant, normalisez les puces et appliquez une approche de clustering hiérarchique pour explorer l’ensemble de données après la normalisation, une analyse significative a été effectuée pour rechercher des gènes exprimés différemment à partir de la procédure de microréseau et a été suivie d’une correction du taux de fausses découvertes sur cinq paires de tumeurs et d’échantillons normaux d’ARN de la prostate.

Cela a conduit à l’identification de 207 jeux de sondes HERV avec des valeurs d’expression différentielles. Une analyse plus poussée de 35 échantillons supplémentaires de paires de correspondances provenant d’autres tissus cancéreux a permis d’identifier 44 ensembles de sondes HERV spécifiques à la prostate. Voici les 10 structures HERV les plus pertinentes.

Enfin, l’analyse fonctionnelle peut être réalisée dans une interface dédiée composée de séquences d’intérêt annotées illustrées par un élément H-E-R-V-W choisi dans les 10 premières structures provirales identifiées étiquetées en haut avec ses sondes spécifiques dédiées présentes sur le réseau H-E-R-V-V deux et marquées avec les régions rétrovirales fonctionnelles LTR gag POLE N, et en mettant l’accent sur les cinq premiers LTRU trois et U cinq sous-domaines, et la conception ultérieure d’amorces PCR pour la validation de la RT PCR. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de maîtriser les étapes critiques impliquées dans la préparation des échantillons et des cibles, qui sont des conditions préalables à la qualité pour réussir dans l’utilisation des microrayons pour la terre, ainsi que la découverte conventionnelle de biomarqueurs. Nous avons conçu une puce à haute densité au format ametri, visant à caractériser de manière optimale l’expression individuelle des loci afin de mieux comprendre s’ils peuvent être actifs si la zone non con sèche NA transcription ou module l’expression des gènes codants.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies chroniques et infectieuses car l’identification systématique des voci actifs peut unifier les hypothèses génétiques, virales et environnementales comme facteurs déclenchants dans diverses pathologies. Travailler avec un nombre limité d’échantillons dans une expérience technique de preuve de concept peut être délicat pour découvrir avec succès des biomarqueurs, prendre des précautions, telles que le respect d’un flux de travail statistiquement validé, y compris la robustesse de la méthode, et un échantillon représentatif de la population de patients ciblée.