La chaleur induite par un antigène de récupération: une méthode efficace pour détecter et identifier les types de cellules progénitrices adultes au cours de l'hippocampe neurogenèse

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une récupération d’antigène sur le tissu cérébral de l’hippocampe afin de mieux visualiser les types de cellules progénitrices à l’origine des neurones nouveau-nés. Ceci est accompli en prélevant d’abord le cerveau perfusé de la souris en coupant de fines sections coronales et en montant ces sections sur une lame de verre, spécialement conçue pour adhérer fortement au tissu. La deuxième étape consiste à faire bouillir les lames avec du tissu et un traitement atopique Kay et à laisser suffisamment de temps pour le refroidissement.

Ensuite, colorez le tissu pendant la nuit avec des anticorps primaires. La dernière étape consiste à effectuer une coloration secondaire des anticorps sur le tissu le lendemain pendant au moins deux heures. En fin de compte, visualisez les différents types de cellules pro-genre à travers les différents stades de développement au cours de la neurogenèse adulte du tissu hippocampique avec la microscopie confocale.

Bonjour, je m’appelle Hun Jo, post-doctorant, membre du laboratoire du Dr Ian John et de la Mayo Clinic. Notre objectif principal au John Lab est d’étudier le processus d’autres neurogenèses dans les troubles neurologiques et psychiatriques. Notre objectif final est de réussir à traduire ces connaissances en application thérapeutique en démontrant que notre procédure de récupération d’antigène sera Quam Hui, et salut John de notre laboratoire.

Le principal avantage de notre technique par rapport aux méthodes existantes d’immunohistochimie est qu’elle permet de visualiser efficacement des types de cellules distincts au cours de la neurogenèse de l’hippocampe adulte. Ces types de cellules, y compris les cellules souches neurales précurseurs qui sont autrement difficiles à détecter, peuvent être efficacement marqués et visualisés à l’aide de notre méthode de récupération d’antigènes. Cette méthode permettra de mieux comprendre le développement et la régulation des neurones du nouveau-né au cours de la neurogenèse de l’hippocampe adulte.

Pour ceux qui s’intéressent à l’étude des troubles mentaux et au traitement pharmacologique, notre récupération d’antigènes s’avérera utile pour étudier le rôle du développement neuronal au cours de cette maladie. Pathogénèse. Commencez la procédure en plaçant le cerveau d’une souris perfusée dans du paraformaldéhyde à 4 % dans un tube conique de 10 millilitres pendant la nuit à quatre degrés Celsius, ou pendant au moins 12 à 24 heures, mais pas plus de 36 heures pour une fixation complète. Après une fixation nocturne, retirez le PFA et laissez le cerveau dans le tube conique.

Ensuite, rincez le cerveau avec 30 % de saccharose pour éliminer tout PFA résiduel et jetez le saccharose. Ensuite, remplissez à nouveau le tube avec 30 % de saccharose et maintenez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que le cerveau coule au fond du tube. Ensuite, coupez l’hippocampe en sections cérébrales de 40 micromètres sur un microtome.

Conservez les sections dans la solution d’antigel jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’immunohistochimie. Montez ensuite les tranches sur les lames de microscope spécialement conçues pour adhérer fortement au tissu. Après avoir monté le mouchoir, laissez sécher les lames pendant environ 10 minutes.

Le séchage peut être accéléré si les lames sont posées contre une surface verticale sur une serviette en papier pour assurer l’élimination complète des produits chimiques précédents. Une fois les lames sèches, lavez-les avec du PB S3 plusieurs fois pendant cinq minutes à chaque fois. Ensuite, laissez sécher à nouveau.

Dans cette procédure, préparez la solution pour l’ébullition des tissus conformément à la description dans le manuscrit ci-joint. Ensuite, faites bouillir la solution pendant cinq minutes dans un micro-ondes standard à réglage standard. Une fois l’ébullition terminée, retirez délicatement le récipient du micro-ondes.

Après cela, transférez les lames séchées dans la solution. Assurez-vous que le côté avec les sections de l’hippocampe est entièrement exposé à la solution. Si possible, placez les diapositives en biais contre les parois du récipient et empilez d’autres diapositives autour d’elles.

Faites ensuite bouillir le mélange avec les lames pendant sept minutes au micro-ondes aux réglages standard. Pendant ce temps, remplissez deux seaux à glace à moitié avec de la glace. Une fois l’ébullition terminée, retirez le récipient du micro-ondes et placez-le dans l’un des seaux à glace.

Versez le reste de la glace de l’autre seau tout autour du récipient et couvrez-le complètement. Après cela, laissez-le reposer pendant une heure après une heure. Retirez les lames du récipient.

Lavez-les avec un tampon TBST trois fois pendant cinq minutes à chaque fois. Ensuite, séchez les lames dans l’obscurité pendant cinq à 10 minutes ou jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches. Pendant ce temps, préparez une chambre avec du DDH deux O pour la coloration primaire des anticorps pendant la nuit.

Une fois que les lames ont séché, tracez un contour autour des sections de tissu à l’aide d’un stylo à eau. Ce contour agit comme une barrière pour empêcher le mélange d’anticorps de s’écouler. Préparez ensuite le mélange d’anticorps primaires dans T-B-S-T-T.

Placez les lames séchées sur la platine dans la chambre de coloration. Ajoutez lentement 500 microlitres de l’anticorps primaire pour couvrir toute la surface. Par la suite, couvrez la chambre de coloration pour bloquer la lumière extérieure et conservez-la toute la nuit à température ambiante le lendemain, lavez les lames trois fois pendant cinq minutes à chaque fois avec un tampon TBST.

Après cela, séchez-les dans l’obscurité. Préparez maintenant le mélange d’anticorps secondaires dans T-B-S-T-T. Placez ensuite les lames sèches dans la chambre de coloration.

Ajoutez 500 microlitres de l’anticorps secondaire. Couvrez lentement la chambre de coloration et gardez-la à l’abri de la lumière extérieure pendant au moins deux heures à température ambiante après la fin de la coloration secondaire, lavez les lames trois fois pendant cinq minutes à chaque fois avec un tampon TBST, séchez les lames dans l’obscurité après le séchage. Ajoutez une solution de montage aux glissières.

Couvrez-les soigneusement avec des lamelles afin d’éviter l’introduction de bulles. Ensuite, gardez les lames dans l’obscurité pendant au moins deux heures avant l’analyse suivante et la réalisation d’une analyse en accéléré ou en convo sur le tissu coloré. La neurogenèse de l’hippocampe adulte est représentée dans la zone subgranulaire du gyrus denté.

Une cellule souche gliale radiale activée, comme une cellule souche de type un, passe par des phases distinctes au fur et à mesure qu’elle se différencie, mûrit et s’intègre fonctionnellement à une morphologie élaborée dans le circuit neuronal. Chacune des phases et les types de cellules respectifs peuvent être identifiés en fonction de l’expression d’une combinaison de marqueurs. MCM deux est un marqueur de prolifération qui est exprimé dans tous les types de cellules progénitrices mitotiques tandis que nein est exprimé parmi les cellules souches gliales radiales et non radiales.

Lorsque les progéniteurs de type A de type deux se différencient, l’expression imbriquée est d’abord désactivée. L’expression anti-TBR deux augmente dans le progéniteur post-mitotique MCM deux, l’expression est perdue tandis que l’expression de DCX et NEWAN dicte la migration et la maturation en un neurone fonctionnel. Il s’agit d’une image confocale représentative de la coloration violette MCM deux neston vert et dappy rouge.

Les images agrandies dans les boîtes montrent un progéniteur radial GL exprimant neston MCM deux et dpi. Voici une image confocale représentative du MCM bleu deux rouges, du TBR deux DCX verts et du dpi gris. La coloration de la caractéristique d’un type de cellule progénitrice de type B de type deux est illustrée dans les images agrandies dans les cases exprimant MCM deux, TBR 2D, c, X et dpi.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler trois choses. Premièrement, utilisez un tissu bien perfusé et fixé de la bonne épaisseur coronale. Deuxièmement, monter le tissu à plat sur les lames et éviter tout dommage.

Et enfin, troisièmement, laisser suffisamment de temps pour l’ébullition et le refroidissement ultérieur pendant la récupération de l’antigène. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la reconstruction du tissu confocal et les expériences comportementales peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont les neurones du nouveau-né peuvent s’intégrer dans les circuits de l’hippocampe et contribuer à la fonction cognitive. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un récupérateur d’antigènes sur votre tissu hippocampique pour visualiser avec une plus grande efficacité, les types de cellules présentatives qui donnent naissance à de nouveaux neurones lors d’autres névroses hippocampiques.