VIGS-Mediated dépistage génétique avant pour l'identification des gènes impliqués dans la résistance non hôte

L’objectif global ici est de démontrer la méthodologie utilisant le silençage génique induit par le virus pour identifier les gènes impliqués dans la résistance non hôte afin d’obtenir des VIG de la plante endogène. Inoculer les plantes de nicotiana hamama avec le virus du hochet du tabac figues construire portant un fragment du gène cible, préparer et inoculer les cultures de pathogènes non hôtes exprimant la protéine fluorescente verte sur le gène silencieux feuilles de la plante. Ensuite, évaluez les colonies fluorescentes vertes d’agents pathogènes non hôtes sous la lumière UV dans l’obscurité.

Afin d’identifier les plantes dont le gène est silencieux et qui compromettent la résistance des non-hôtes, identifiez le gène cible en séquençant l’insert dans le vecteur viral. Dans l’ensemble, cette méthodologie de criblage génétique direct médiée par VIX permet aux chercheurs d’identifier facilement les gènes impliqués dans la résistance des plantes non hôtes contre les agents pathogènes bactériens. En peu de temps, nous avons réalisé que l’importance de combiner le silençage génique induit par le virus médiait la génétique ascendante avec les agents pathogènes exprimant la GFP UV pour identifier les gènes non responsables de la résistance au ST.

Alors que nous faisions auparavant un dépistage génétique avancé fastidieux en marquant la mort cellulaire induite par l’hyperréponse et la mort cellulaire induite par la maladie. Ainsi, les graines de nicotiana Ben sur un mélange de rempotage sans sol font germer les graines dans une chambre de croissance. Après trois semaines, transplantez les plants dans des pots individuels, cultivez-les dans une serre pendant au moins deux à trois jours avant le virus du hochet du tabac.

L’inoculation vectorielle des figues dégèle progressivement les tiges congelées d’agrobacterium contenant les clones d’ADNc. Dans des conditions stériles, deux vecteurs inoculent les cultures individuelles d’agrobactéries sur Luria. Les plaques Berti agro incuber les plaques à 28 degrés Celsius pendant deux jours maximum.

Cultiver quatre colonies répétées pour chaque clone afin qu’un inoculum adéquat d’agrobacterium soit disponible pour l’inoculation de deux plantes. Inoculer TRV un dans le milieu liquide Luria berti. Récoltez les cultures cultivées pendant la nuit par centrifugation, remettez les bactéries en suspension dans l’inoculation, tamponnez et incubez pendant trois heures à température ambiante sur un agitateur à 50 tr/min.

Après avoir récolté les cellules par centrifugation, mesurez la densité optique et suspendez les pastilles bactériennes dans cinq tampons MES millimolaires pH 5,5 Ensuite, inoculez la culture bactérienne T RV une culture bactérienne ayant OD 600 de 0,3 dans le côté axi de trois à quatre feuilles de nicotiana hamama à l’aide d’une seringue sans aiguille au site de l’inoculation T RV one. Piquez les feuilles avec l’inoculum des deux colonies respectives de T RV à l’aide d’un cure-dent pendant deux semaines. Maintenez les plantes à basse température avec une nutrition adéquate, car une croissance vigoureuse est importante pour un silençage génique efficace par les porcs.

À titre d’exemple, la tomate T one de Pseudomonas senge PV est utilisée dans cette expérience. Les agents pathogènes doivent porter un plasmide capable d’exprimer G-F-P-U-V croissance les souches de PGE dans les rois être liquide, moyen complété avec 10 microgrammes par millilitre. Rifampicine 50 microgrammes par millilitre peut myciner à 28 degrés Celsius pendant 12 heures.

Récoltez les cultures bactériennes par centrifugation, puis confirmez la présence de fluorescence verte à l’aide d’une lampe UV à longue longueur d’onde dans l’obscurité. Après deux lavages à l’eau stérile, les cellules sont suspendues à la concentration souhaitée d’eau stérile et ajustent OD 600. Ensuite, inoculez les agents pathogènes respectifs sur le côté axial de la cible.

Cercles de feuilles silencieux d’environ 1,5 centimètre de diamètre si nécessaire. Testez simultanément plusieurs agents pathogènes non hôtes pour leur croissance dans le gène cible, les plantes silencieuses incluent également un contrôle vectoriel pour l’observation. Implantez une croissance bactérienne entre deux et cinq jours.

Exposez les feuilles inoculées à une lumière UV de longue longueur d’onde dans l’obscurité. Assurez-vous de porter une protection cutanée et oculaire. Surveillez les colonies bactériennes sous forme de taches fluorescentes vertes sur la face axiale de la feuille en arrière-plan de la fluorescence rouge émise par la surface de la feuille.

Vérifiez la fluorescence verte émise par l’agent pathogène hôte qui agit comme un contrôle positif. Observez la croissance des agents pathogènes tous les jours de deux à cinq jours après l’inoculation. Faites une liste des clones qui, en réduisant au silence, ont entraîné la croissance d’un ou plusieurs agents pathogènes non hôtes.

Pour supprimer les faux positifs du premier écran. Répétez les VIG pour des clones sélectionnés et à nouveau, testez la réponse des plantes dont les gènes sont silencieux aux agents pathogènes non rentables. Utilisez la PCR de colonie sur le clone sélectionné pour amplifier l’insert à l’aide de l’insert A TTB et d’une amorce TB deux dans le T RV deux vecteurs ou des amorces masquant le site de clonage.

Exécutez le produit PCR sur un gel aros et vérifiez l’amplification de la bande unique. Ensuite, séquencez l’insertion du gène de la plante dans le vecteur T RV deux à l’aide des amorces A TTB ou des amorces flanquant le site de clonage. Effectuez une explosion à l’aide de la séquence et identifiez les détails du gène.

Un protocole généralisé pour réduire au silence un grand nombre de gènes à l’aide de figues à base de virus du hochet du tabac dans la nicotiana. Hamana est illustré dans cet organigramme. Certaines des plantes dont le gène a été réduit au silence ont montré diverses altérations phénotypiques, notamment un retard de croissance, un jaunissement et des phénotypes de photoblanchiment.

Ces données montrent une fluorescence verte de l’agent pathogène exposé à la lumière UV dans l’obscurité avant l’inoculation de la plante et ses implants de croissance trois jours après l’inoculation, la même feuille exposée à la lumière blanche est montrée comme témoin. Cette expérience suit la croissance des bactéries exprimant G-F-P-U-V dans la plana. Trois non-hôtes.

Les agents pathogènes ont été utilisés pour démontrer le processus d’identification du gène plante silencieuse sensible aux agents pathogènes non hôtes dans le type sauvage des plantes nicotiana hamama non silencieuses avec immunité. Ces agents pathogènes ne se sont pas développés. Cependant, au moins deux agents pathogènes non hôtes se sont développés sur les feuilles du NB sgt.Un

gène a réduit les feuilles au silence. Les données quantitatives sur la croissance bactérienne démontrent le processus d’identification des plantes génétiquement réduites et compromises pour une résistance non ST. En utilisant cette approche génétique directe médiée par les figues, nous avons réduit au silence environ 5 000 gènes chez nicotiana hamana et identifié des plantes compromettant une résistance non ST sur une période d’environ un an et demi.

À titre d’exemple, la croissance d’agents pathogènes non hôtes dans deux plantes génétiquement réduites identifiées à partir de cet écran est illustrée ici. Nous espérons avoir expliqué comment effectuer un silençage génique induit par un virus pour des centaines de gènes, puis évaluer les plantes réduites au silence en observant la croissance d’agents pathogènes non coûteux dans la plana pour disséquer la résistance non coûteuse. En utilisant ce protocole médié par le silençage de ce gène induit par le virus, on peut faire taire des centaines de gènes dans une période d’environ deux à trois semaines, puis évaluer la croissance d’agents pathogènes non équins marqués avec GFP UV en environ deux à trois heures par jour, sur une période d’environ deux à cinq jours.