En utilisant l'ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser l’interférence ARN pour étudier l’effet des gènes candidats sur la réponse immunitaire innée. Dans les macrophages de souris pour ce faire, les lignées cellulaires de macrophages de souris sont tryps inisées et combinées avec une solution de transfection et les ARN SI d’intérêt, le mélange est ensuite transféré sur une plaque VETE de nucléo à 96 puits et un système de transfection Maxa à 96 puits est utilisé pour transfecter les siRNA dans les macrophages et après une incubation avec culture cellulaire, Le milieu, le LPS ou d’autres activateurs de l’immunité innée sont appliqués aux macrophages transfectés pour les stimuler. Enfin, les Eliza sont ensuite effectuées pour surveiller la production de cytokines et évaluer l’effet du traitement par siRNA sur la réponse immunitaire innée.

Le principal avantage de cette technique par rapport à la transfection médiée par les lipides est que notre test est robuste et peut être appliqué à de nombreux gènes dans les professions à haut débit. La clé de cette méthode est de travailler avec des cellules saines, de les traiter doucement et de travailler efficacement pendant le processus de transfection. Comme nous allons le démontrer, ce protocole utilise la lignée cellulaire brute de macrophages de souris 2 64 0,7, qui est cultivée comme décrit dans le document d’accompagnement.

En préparation de la plaque de transfection INA, les cellules à 20 % de fluidité et se développent un ou deux jours jusqu’à ce qu’elles ne soient pas confluentes à plus de 80 %. Il est important de ne pas oublier d’utiliser des cellules situées entre les passages trois et 10. Après la décongélation, commencez cette procédure en programmant le système de navette à 96 puits qui sera utilisé pour la transfection.

Pour ce faire, lancez le logiciel de la navette à 96 puits sur l’ordinateur connecté à la navette à partir du menu Fichier en haut à gauche. Sélectionnez un nouveau fichier de paramètres. Mettez en surbrillance les puits qui seront transfectés sur le schéma affiché de la plaque à 96 puits.

Une case verte indiquera les puits sélectionnés. Choisissez le programme qui correspond à la lignée cellulaire de macrophage utilisée pour les cellules brutes de 2 64 0,7. Choisissez DS 1 36 sélectionnez Appliquer.

Notez qu’après avoir sélectionné un programme, les puits sur la plaque schématique seront colorés. Les cercles vides bleu foncé indiquent les puits qui n’ont pas reçu de programme et qui ne seront pas choqués. Ensuite, préparez la solution d’effecteur de nucléo fonctionnelle en mélangeant la solution d’effecteur de nucléo de 96 puits de la lignée cellulaire SF avec tout le contenu du tube de supplément inclus.

Laissez les réactifs mélangés s’équilibrer à température ambiante. Réchauffez le D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0,25 % en EDTA et PBS à 37 degrés Celsius. Préparez le plasmide de contrôle expérimental S-I-R-N-A-P max GFP ou les siRNA marqués par fluorescence en les décongelant sur de la glace pour détacher les macrophages adhérents des boîtes de culture cellulaire.

Aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS. Ensuite, après avoir retiré le PBS, incubez les cellules avec un millilitre de 0,25 % de tripsin EDTA pré-averti par plaque jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher. Cela prend une à deux minutes.

Tapotez doucement la plaque et déplacez la solution pendant l’incubation pour maximiser la trypsinisation. Une fois les cellules détachées, ajoutez neuf millilitres de DMEM et de mélange FBS doucement en pipetant de haut en bas, puis collectez les cellules en pipetant dans un tube stérile. Comptez le nombre de macrophages isolés à l’aide d’un cytomètre Hema.

Attendez-vous à environ 10 millions de macrophages par plaque de 10 centimètres. Calculez le nombre total de macrophages nécessaires : chaque puits de la navette de 96 puits nécessite 200 000 cellules. Pipetez le nombre calculé de cellules dans un tube à centrifuger.

Faites tourner les cellules pendant 10 minutes à 150 g à température ambiante sur une plaque inférieure ronde stérile à 96 puits, ce qui facilite le mélange tout en minimisant les pertes de réactifs. Ajouter deux microlitres de chaque IRNA dans chaque puits à transfecter. Notez qu’en fonction du nombre d’ARNi, cela peut être accompli lors de l’étape de centrifugation des macrophages.

L’aspect le plus difficile de cette procédure est l’électroporation, les clés qui traitent les cellules très doucement et pour fonctionner très rapidement. Une fois que les cellules sont dans une solution de transfection toxique, aspirez le milieu des cellules de centrifugation, puis remettez-les doucement en suspension dans une solution d’effecteur de noyaux. SF contenant la solution de supplément.

Transférez immédiatement les cellules dans une auge stérile à l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 20 microlitres du mélange cellulaire remis en suspension dans chaque puits de la plaque à 96 puits contenant les ARNi délicatement mélangés en pipetant de haut en bas. Ensuite, transférez 20 microlitres du mélange de cellules INA dans la plaque de nucléo vete à 96 puits. Il est essentiel d’éviter de générer des bulles au cours de cette étape, car cela peut induire des erreurs lors de l’affection du nucule.

Après avoir placé tous les échantillons expérimentaux dans la plaque de transfection, couvrez-la avec le couvercle fourni et tapotez-la très doucement sur une surface dure. Pour éliminer les bulles, placez la plaque à 96 puits dans la navette effectrice de nucléo à 96 puits, et en bas à droite de l’écran du programme, sélectionnez télécharger et démarrer. Suivez ensuite l’invite du programme pour enregistrer les résultats pendant le processus d’affection nucléotique avec succès.

Le transfected sera représenté sur le schéma de 96 puits à l’écran par un cercle vert avec un signe plus. Un cercle rouge avec un signe moins indique une erreur probablement due à des bulles ou au pipetage du mauvais volume de réactifs immédiatement après l’affection du nucléo. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 80 microlitres de préchauffage RPMI 1640.

Moyen sur le côté de chacun. Eh bien, laissez le milieu se mélanger lentement avec les cellules transfectées, qui sont très délicates à ce stade. L’ajout du milieu trop rapidement diminuera considérablement la viabilité.

Placez la plaque à 96 puits avec les échantillons transfectés et le RPMI 1640 dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant deux minutes ou plus. Il est essentiel de permettre aux cellules de récupérer avant de poursuivre la manipulation. Après avoir retiré la plaque de l’incubateur, utilisez une pipette multicanaux pour transférer soigneusement le mélange de chaque puits dans une plaque de culture tissulaire de 96 puits.

Là encore, à l’aide de la pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de DMEM avec FBS à chacun. Bien incuber pendant 24 à 36 heures immédiatement après la transfection et la récupération effectuer une cytométrie en flux. Pour évaluer l’efficacité de transfection de l’ARNi SI marqué par fluorescence, plus de 99 % des cellules doivent être transfectées le lendemain du test de transfection. Pour l’efficacité de transfection du plasmide GFP, 30 à 50 % des cellules doivent exprimer la GFP Après l’incubation de 24 à 36 heures, préparez le LPS ou d’autres activateurs de l’immunité innée dans un milieu frais diluez le LPS à une concentration finale de 20 nanogrammes par millilitre dans du DMEM avec FBS.

Ensuite, aspirez soigneusement le milieu de la plaque à 96 puits et ajoutez le milieu frais contenant le LPS dans les cellules. Placez la plaque dans un incubateur pour surveiller la réponse au LPS ou à d’autres stimulateurs de l’immunité innée à différents moments après la stimulation. Pipeter le surnageant des cellules dans une plaque de stockage de 96 puits pour analyse par Eliza.

Après avoir retiré le surnageant pour surveiller la viabilité cellulaire, ajoutez 100 microlitres d’un à 100 diacétate de fluorescéine dans du PBS dans chaque puits d’incubation à température ambiante pendant une à cinq minutes. Surveillez la fluorescence dans les cellules à l’aide d’un lecteur de plaques lorsqu’elles sont clivées par des estérases cellulaires dans des cellules vivantes. Ce composé devient fluorescent pour illustrer l’utilité de cette approche pour surveiller la réponse immunitaire innée.

Les siARN ciblant des gènes régulateurs immunitaires innés connus ont été transfectés dans la lignée cellulaire brute de macrophages 2 64 0,7. Les cellules ont ensuite été stimulées avec du LPS et la production de cytokines pro-inflammatoires. L’IL six et le TNF alpha ont été surveillés par Eliza, comme le montre le présent document.

Inhibition du récepteur quatre de type Toll, le récepteur du LPS, mais pas des autres TLR. En utilisant SIR, une production fortement diminuée de LPS a induit l’IL six et le TNF alpha. Notez que l’inhibition de l’IL six avec l’ARNir a diminué la production d’IL six, mais n’a pas affecté la production de TNF alpha.

Ces données suggèrent une bonne efficacité et une bonne spécificité de l’inactivation médiée par les siRNA des régulateurs candidats de l’immunité innée. Il est important de se rappeler que la clé d’une bonne transfection et d’une bonne récupération cellulaire est de travailler avec des cellules très saines, de les traiter doucement pendant le processus de transfection et de récupération, et de travailler rapidement une fois que les cellules sont dans une solution effectrice de nucléos. À la suite de cette procédure, de nombreux autres tests peuvent être effectués, y compris la QPCR pour surveiller l’inactivation des gènes et de nombreux autres tests pour étudier la réponse immunitaire innée.