Un protocole pour l'analyse de l'hépatite C de réplication

L'objectif général de cette procédure est d'étudier différentes étapes du cycle de réplication du virus de l'hépatite C. Cette approche repose tout d'abord sur la génération de transcrits d'ARN génomique du VHC à partir de constructions plasmidiques du VHC linéarisées. La deuxième étape consiste à transfecter les cellules avec l'ARN du VHC. Ensuite, les cellules sont mises en culture à différents points de temps et soumises à divers tests. La dernière étape consiste à recueillir le surnageant de culture cellulaire afin de mesurer le titre viral, ainsi qu'à récolter les cellules transfectées pour l'extraction de protéines et d'ARN. Finalement, des analyses par RT-PCR, immunobuvardage (Western blot), test d'immunofluorescence et dosage du titre du VHC sont réalisées, démontrant ainsi un système de culture cellulaire infectieuse robuste pour le VHC.

L'avantage principal de ce système de culture cellulaire du virus de l'hépatite C infectieux par rapport au système de réplicon du VHC est qu'il permet d'étudier l'entrée virale, l'assemblage des virions et les étapes d'égersion. Ce protocole peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la virologie de l'hépatite C, telles que la morphogenèse des virions et l'interaction hôte-pathogène. Les implications de cette technique s'étendent vers le développement de vaccins, car elle permet la caractérisation de souches virales atténuées pouvant être évaluées comme candidats vaccins potentiels.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le virus de l'hépatite C, elle peut également être appliquée à d'autres virus à ARN de la famille des Flaviviridae. En général, les personnes novices dans cette méthode seront confrontées au défi de produire un ARN génomique de haute qualité du VHC. L'étude du cycle de réplication complet du VHC est devenue possible en culture cellulaire suite à la découverte d'un isolat japonais de l'hépatite fulminante à VHC de génotype 2A. La démonstration visuelle des tests virologiques est essentielle, car ces tests exigent une expertise tant en techniques moléculaires qu'en techniques cellulaires.

En utilisant un virus chimérique intragénotype 2A, F-N-X-H-C-V et F-N-X-H-C-V dépourvu de polymérase pour l'évaluation de la réplication virale, linéariser les plasmides viraux précédemment générés par digestion avec l'enzyme de restriction XBA-un dans un tube de deux millilitres. Ensuite, traiter les plasmides avec la nuclease de haricot mungo pour générer des extrémités franches.

Purifiez les plasmides digérés par chromatographie d'échange d'anions. Vérifiez l'intégrité du plasmide linéarisé en soumettant l'ADN à une électrophorèse sur gel d'agarose. Ensuite, ajoutez le modèle d'ADN plasmidique linéarisé dans un tube de 0,2 millilitre contenant les composants de la réaction de la polymérase ARN T-sept pour synthétiser les transcrits d'ARN génomique du VHC.

Purifiez l'ARN nouvellement synthétisé traité par la DNase à l'aide d'un kit de purification de l'ARN. Ensuite, vérifiez la production d'ARN par électrophorèse sur gel d'agarose. Après cela, quantifiez l'ARN par spectrophotométrie.

Détacher les cellules adhérentes de type Huh-7 à l’aide d’un traitement enzymatique à la trypsine et recueillir les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Après deux centrifugations successives, resuspendre le culot cellulaire dans un milieu pauvre en sérum, refroidi. Après répétition de la centrifugation, resuspendre les cellules dans un milieu pauvre en sérum à une concentration de 1 × 10⁷ cellules par millilitre.

Ensuite, mélanger un total de 10 microgrammes d'ARN viral transcrit avec 400 microlitres de cellules resuspendues dans une cuvette d'électroporation prérefroidie de 0,4 centimètre. Introduire l'ARN viral dans les cellules par électroporation à 270 volts, 100 ohms et 950 microfarads. Une fois terminé, resuspendre les cellules électroporées dans 10 millilitres de milieu de croissance complet contenant 15 % de FBS. À ce stade, ensemencer les cellules dans des flacons T25 à environ 1,2 × 10⁶ cellules par flacon et dans des plaques de 48 puits à 1 × 10⁴ cellules par puits pour des points temporels de 4, 48 et 96 heures. Remplacer le milieu entre quatre et huit heures après la transfection par un milieu de croissance frais supplémenté contenant 10 % de FBS afin d'éliminer les débris cellulaires morts des flacons et des plaques en culture.

À l’aide d’une pipette sérologique, récolter les surnageants de culture cellulaire aux points temporels de 48 et 96 heures dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, éliminer les débris cellulaires des échantillons recueillis par centrifugation à 15 000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, conserver les surnageants acellulaires à moins 80 degrés Celsius.

Lysis des cellules pour l'analyse des protéines et de l'ARN par immunotransfert et PCR quantitative en temps réel avec transcriptase inverse ou RT-qPCR aux points temporels indiqués. Réaliser la transcription inverse d'un microgramme d'ARN cellulaire total à l'aide d'une enzyme transcriptase inverse et d'un amorce spécifique de la chaîne sens du VHC qui se fixe à la région non traduite en 5'. Effectuer également la transcription inverse de F-N-X-H-C-V-R-N-A contenant un nombre connu de copies génomiques à l'aide d'un amorce de la chaîne sens du VHC. À l’aide d’un système de PCR en temps réel, réaliser la qPCR en utilisant 50 nanogrammes de l’ADNc transcrit résultant, avec des amorces spécifiques du VHC et un mélange super-qPCR contenant un colorant vert se liant à l’ADN. Utiliser les conditions suivantes lors de l’exécution de la qPCR afin de déterminer le nombre de copies de R-N-A du V-H-C. Après la qPCR, séparer le lysat cellulaire provenant de l’ARN viral transfecté à 96 heures post-transfection par électrophorèse SDS-PAGE. Puis transférer les protéines séparées dans le gel vers une membrane de difluorure de polyvinylidène selon la méthode trans-blot turbo. Bloquer la membrane à l’aide d’une solution de blocage contenant 5 % de lait écrémé et 0,2 % de Tween-20 dans le PBS, puis la placer dans un récipient.

Incuber la membrane avec l'anticorps primaire monoclonal de souris NS3 à une dilution de un sur 1 000 et avec la bêta-actine à une dilution de un sur 5 000 dans une chambre froide à quatre degrés Celsius. Après l'incubation, ajouter l'immunoglobuline G de chèvre anti-souris conjuguée à la peroxydase de raifort à une dilution de un sur 5 000 et détecter par chimiluminescence.

À ce stade, fixez les cellules transfectées par le H-C-V-R-N-A à l’aide de méthanol pendant 30 minutes à moins 20 degrés Celsius pour le test d’immunofluorescence. Une fois terminé, lavez les cellules trois fois avec du PBS. Après blocage avec le tampon de blocage pour le test d’immunofluorescence, utilisez l’anticorps primaire polyclonal de lapin anti-NS5A et l’anticorps monoclonal de souris anti-ARNsd J2 à une dilution de un à 200, puis incubez de cinq heures à toute la nuit dans une chambre froide à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, lavez les cellules trois fois avec du PBS après l’ajout de l’anticorps primaire. Ensuite, ajoutez l’anticorps secondaire polyclonal IgG de chèvre anti-lapin 488 et l’anticorps secondaire polyclonal Ig de chèvre anti-souris 594 à une dilution de un sur 1000, puis incubez pendant une heure à température ambiante sur un agitateur rotatif. Après avoir lavé les cellules trois fois avec du PBS, coloriez les noyaux à l’aide du colorant Hoechst et observez au microscope à fluorescence.

Ensuite, ensemencez des cellules Huh7.5.1 naïves à environ trois fois 10 à la puissance trois cellules par puits en utilisant une plaque de 96 puits. Le jour suivant, effectuez une dilution sérielle décimale du surnageant de culture dépourvu de cellules, récolté à partir de cellules transfectées par ARN du VHC, en utilisant le milieu de croissance, puis inoculez-le en triple exemplaire sur des cellules Huh7.5.1. Fixez les cellules 72 heures après l'infection à l'aide de méthanol pendant 30 minutes à moins 20 degrés Celsius. Après avoir retiré les cellules du congélateur, effectuez une immunomarquage pour la protéine NS5A du VHC dans les conditions précédemment décrites. À l’aide d’un microscope à fluorescence, comptez les foyers cellulaires positifs pour NS5A dans le puits présentant la dilution virale la plus élevée, puis calculez le nombre moyen d’unités formant des foyers par millilitre.

La qualité du plasmide VHC linéarisé a été évaluée par électrophorèse sur gel. L'ADN VHC a été soumis à une transcription in vitro médiée par la polymérase ARN T7, produisant un unique produit ARN de 9,6 kilobases. Les résultats de RT-qPCR ont indiqué que le virus de type sauvage répliquait efficacement le génome. Le type sauvage présentait un niveau de réplication du génome supérieur d'un à trois logarithmes par rapport au virus pol-nul.

Le virus sauvage produit la protéine NS3 impliquée dans le clivage des protéines virales et la réplication du génome. Le virus sauvage exprime également la protéine NS5A, et la protéine NS5A ainsi que l'ARN double brin co-localisent dans le cytoplasme cellulaire des cellules transfectées avec le virus sauvage, suggérant une réplication virale active. Les mesures de titrage viral ont indiqué que le virus sauvage est infectieux et produit plus de 10 000 unités formant des foyers par millilitre de particules infectieuses. Six heures après la transfection, les virus sauvage et pol-null présentaient des activités luciférase similaires, indiquant un niveau comparable de traduction de l'ARN transfecté. Cependant, 48 et 96 heures après la transfection, le virus sauvage présentait des niveaux accrus de réplication du génome par rapport au virus pol-null. Le virus sauvage produisait également la protéine virale NS3. Le virus poll null présentait une activité luciférase de base, tandis que le virus sauvage affichait un niveau de réplication deux à trois fois supérieur en logarithme par rapport au virus rapporteur pol-null. Une fois maîtrisées, les analyses virologiques de l'hépatite C peuvent être réalisées en deux semaines si elles sont effectuées correctement. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est essentiel de disposer de cellules robustes et de transcrits d'ARN génomique de VHC de haute qualité. Après cette procédure, des souches de VHC caractérisées peuvent être testées dans des modèles animaux afin d'étudier leur aptitude in vivo et leurs interactions hôte-pathogène.

Le développement d'un système de culture cellulaire infectieuse pour le VHC a permis aux chercheurs d'explorer les étapes de la morphogenèse des virions et de l'égrenage viral dans le cycle de réplication du VHC. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer divers dosages virologiques afin de caractériser différentes étapes du cycle de réplication du virus de l'hépatite C. N'oubliez pas que le travail avec le virus de l'hépatite C peut être extrêmement dangereux et que des précautions de sécurité, telles que le port d'équipements de protection individuelle adaptés, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.