L'utilisation d'un α-bungarotoxine Reliure Tag du site à étudier récepteur GABA A membrane localisation et le trafic

L’objectif global de cette procédure est de mesurer la localisation de surface du récepteur gabaa et l’endocytose dans les neurones de l’hippocampe. Ceci est accompli en transectant d’abord les neurones de l’hippocampe avec la sous-unité du récepteur gabaa marquée et en permettant aux neurones cultivés de se développer dans l’incubateur. La deuxième étape consiste à marquer les récepteurs gabaa de surface avec une puce Alexa fluorescente couplée à l’alpha bungalow toin.

Ensuite, les neurones sont incubés à différents moments afin de permettre l’endocytose des récepteurs marqués. La dernière étape consiste à fixer les échantillons aux points temporels appropriés et à effectuer une immunocoloration à l’aide d’un anti-GFP pour observer le pool total de récepteurs marqués. En fin de compte, la microscopie confocale est utilisée pour montrer les changements dans la localisation de surface et l’endocytose des récepteurs gabaa marqués à l’aide d’approches d’imagerie fixes ou en direct.

Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine du trafic de récepteurs, telles que l’effet que la liaison des ligands peut avoir sur l’endocytose des récepteurs et les taux d’insertion, et si différents ligands et modulateurs peuvent affecter le recyclage et la dégradation des récepteurs. Bien que cette méthode ait été utilisée pour étudier les canaux ioniques ligaturés et les récepteurs couplés aux protéines G principalement dans le contexte du système nerveux, elle peut également être appliquée pour étudier la localisation dynamique et le trafic d’autres protéines membranaires dans la culture cellulaire et les cellules primaires de divers tissus. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés pour deux raisons.

Premièrement, pour créer des constructions fonctionnelles et deuxièmement, la pratique et les expériences nécessaires pour traiter plusieurs points temporels simultanément. Pour commencer, préparez quatre à cinq plaques rondes en verre revêtu de poly de lysine à l’intérieur de chaque boîte de culture tissulaire de 3,5 centimètres, comme décrit dans le protocole de texte. Ensuite, transfectez les neurones fraîchement dissociés le jour de la culture avec un à quatre microgrammes de plaque d’ADN de construction maxi préparée.

Les neurones transfectés sur la couverture recouverte de poly de lycine glissent à une densité finale d’environ 200 000 neurones par boîte de 3,5 centimètres. Remplacer le milieu quatre à 24 heures après la préparation des cultures neuronales. Laissez ensuite les neurones se développer dans l’incubateur jusqu’à 14 à 17 jours in vitro ou l’étape souhaitée pour effectuer le test d’endocytose.

Réglez d’abord un appareil de chauffage rafraîchissant de paillasse à 16 degrés Celsius. Refroidissez des tas extracellulaires, une solution saline tamponnée ou HBS à 16 degrés Celsius dans un bain-marie. Transférez les paraboles de neurones sur la plaque d’aluminium à 16 degrés Celsius et laissez refroidir pendant cinq minutes.

Retirez le milieu et remplacez-le par un millilitre de 16 degrés Celsius HBS plus 150 micromolaires deux Bo Rine pendant deux minutes. Ensuite, retirez le support dans un conteneur à déchets étiqueté et remplacez-le par un millilitre de 16 degrés Celsius HBS plus deux bo kérine plus la toxine alpha bungalow. Alexa 5 9 4 en incubation à 16 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Après l’incubation, transférez le milieu dans un conteneur à déchets étiqueté et lavez la vaisselle trois fois avec deux millilitres de 16 degrés Celsius HBS pour des expériences de séries chronologiques d’imagerie en direct après endocytose du récepteur à l’aide d’une boîte de culture à fond de verre de 3,5 centimètres. Transférez la boîte sur une platine chauffée du microscope et commencez l’imagerie avec un microscope confocal ou sur gazon. Configurer pour les bordereaux de protection fixes.

Le transfert T équivaut à zéro point de temps et se glisse dans un plat de 4 % de paraformaldéhyde, 4 % de saccharose pendant 20 minutes pour les autres points de temps. Remplacez l’HBS par un milieu conditionné équilibré à 37 degrés Celsius et retournez à l’incubateur pour l’endocytose à 37 degrés Celsius aux points temporels nécessaires. Sortez la vaisselle de l’incubateur et lavez-la rapidement deux fois avec deux millilitres de phosphate de Delcos, de solution saline tamponnée ou de DPBS.

Fixez ensuite l’échantillon dans 4 % d’aldéhyde paraforme, 4 % de saccharose pendant 20 minutes. Après une fixation de 20 minutes, retirez 4 % d’aldéhyde paraforme, 4 % de saccharose dans le récipient à déchets et lavez la vaisselle deux fois avec deux millilitres de DPBS à température ambiante. Ensuite, incubez les lamelles à température ambiante pendant 10 minutes.

Une solution de bloc d’immunofluorescence contenant 0,2 % de Triton X 100 pour permer les neurones et permettre l’immuno-coloration anti-GFP du pool de récepteurs intracellulaires et/ou le marquage d’autres protéines d’intérêt. Retirez ensuite la solution de bloc perméable et incubez les lamelles de recouvrement dans une solution de bloc d’immunofluorescence sans Triton X 100 pendant 20 à 30 minutes. Effectuer des incubations d’anticorps primaires de lamelles en bloc pendant plusieurs heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius après l’incubation.

Lavez les lamelles en les trempant dans du DPBS pendant cinq minutes pour un total de trois lavages. Ensuite, incubez les lamelles avec des anticorps secondaires dans une solution en bloc pendant une heure à température ambiante après une heure. Lavez les lamelles trois fois avec du DPBS comme précédemment.

Ensuite, montez chaque lamelle en retirant l’excès de liquide à l’arrière de la lamelle avec du tissu de laboratoire, puis en inversant la lamelle sur quatre microlitres de support de montage sur une lame de verre. Effectuez l’acquisition d’images avec la microscopie confocale en aveugle aux conditions expérimentales à l’aide d’une ouverture numérique à l’huile de 60x. 1.49 Objectif d’immersion.

En utilisant les mêmes paramètres d’acquisition d’images, acquérez des images en coupe Z unique avec le corps cellulaire neuronal et plusieurs processus dendritiques en focale, quantifiez la toxine alpha bungalow, le signal fluorescent Alexa et l’immunocoloration GFP le long de 20 microns de trois à quatre dendrites proximales par neurone en utilisant le même seuil pour l’analyse de toutes les données d’endocytose. Analysez les données de 10 à 12 neurones pour chaque point temporel. Répéter l’expérience avec plusieurs cultures neuronales indépendantes.

Les axones GABAergiques établissent des contacts inhibiteurs sur les dendrites des neurones pyramidaux. Les terminaisons inhibitrices pré-synaptiques sont identifiées par le transporteur d’acides aminés inhibiteur vésiculaire qui charge le GABA et la glycine dans les vésicules synaptiques. Les récepteurs GABA a sont étroitement opposés aux sites de libération des neurotransmetteurs attachés par l’échafaudage inhibiteur post-synaptique Protéine gein montrée ici sont alpha deux phg F-P-B-B-S exprimant des neurones avec des récepteurs gabaa de surface marqués avec la toxine bungalow Alexa 5 9 4 suivie d’une immunocoloration pour la population totale de récepteurs avec un anticorps anti-GFP montré en vert, et soit la protéine d’échafaudage inhibitrice post-synaptique gein, soit le transporteur d’acides aminés inhibiteur vésiculaire.

Ici, l’endocytose de l’alpha deux contenant le récepteur GABA A et des neurones de l’hippocampe à 15 jours in vitro est montrée par la toxine alpha bungalow. Les mesures des processus dendritiques individuels, telles qu’elles sont présentées dans les panels, sont normalisées au niveau d’expression de la construction via les anticorps GFP. La comparaison finale des points temporels est effectuée par normalisation à la mesure T égale zéro.

La meilleure façon de décrire la quantification de l’internalisation des récepteurs sur une période de 60 minutes à partir des changements du signal fluorescent au fil du temps est une seule exponentielle. Une autre approche consiste à suivre l’endocytose du récepteur dans un seul neurone par microscopie confocale time-lapse d’imagerie en direct. La fluorescence ponctuée et chevauchante du récepteur GABA A marqué P-H-G-F-P et des récepteurs marqués à la toxine bungalow alpha de surface est visible au début de l’expérience au cours du temps où le signal du récepteur GABA A marqué par la toxine alpha bungalow diminue à mesure que les récepteurs s’endocytosent.

Alors que le signal P-H-G-F-P reste élevé en raison de l’insertion de nouveaux récepteurs, la diminution minime du signal P-H-G-F-P est due à des changements de distribution des récepteurs de surface cellulaire et au photoblanchiment suivant cette procédure. D’autres méthodes, comme les tests d’insertion de toxines bungalow, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que les taux d’insertion de récepteurs avec différents traitements. Cette technique permet d’évaluer comment l’activité cellulaire, des domaines protéiques spécifiques, des agonistes et d’autres modulateurs peuvent modifier le renouvellement des récepteurs dans les neurones vivants, d’autres cellules et tissus.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les colorants Alexa couplés à la toxine alpha bungalow en combinaison avec des techniques immunofluorescentes standard pour quantifier la localisation des récepteurs de surface dans les neurones de l’hippocampe.