Mince couche chromatographique (CCM) Séparations et essais biologiques d'extraits végétaux pour identifier des composés antimicrobiens

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les métabolites végétaux qui sont antimicrobiens pour les bactéries anaérobies. Ceci est accompli en séparant d’abord un extrait de plante par chromatographie sur couche mince ou TLC. Ensuite, le chromatogramme est découpé en zones comprenant un ou plusieurs composés.

Les zones sont ensuite placées sur de la gélose inoculée avec des bactéries anaérobies et incubées. Après l’incubation, les zones sont éliminées et les plaques sont colorées pour identifier les composés qui inhibent la croissance bactérienne. Les données qui en résultent révèlent la présence ou l’absence de métabolites végétaux antimicrobiens.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la nutrition des ruminants, telles que les effets des métabolites secondaires des plantes sur l’utilisation des nutriments par des micro-organismes spécifiques. Bien que cette méthode révèle des composés végétaux inhibiteurs des bactéries rumines. Il peut également être appliqué pour révéler des composés inhibiteurs d’autres bactéries ou champignons.

Dans ce protocole, des composés phénoliques du trèfle rouge seront utilisés pour démontrer l’identification des composés antimicrobiens par biographie de contact. Commencez par nettoyer les plaques de chromatographie sur couche mince ou de CCM en travaillant dans une hotte. Préparez suffisamment de solvant de nettoyage pour couvrir le fond de la chambre de développement CCM, ainsi que le bord inférieur de la plaque CCM.

Lorsqu’il est placé à l’intérieur de la chambre ici, l’acétate d’éthyle méthanol deux à un est préparé. Ensuite, porter des gants et travailler dans une hotte. Utilisez des ciseaux pour couper des plaques de silice flexibles en aluminium ou en plastique pour s’adapter à la chambre de développement.

Insérez les plaques dans la chambre avec les sommets appuyés contre les parois de la chambre. Les plaques ne doivent pas se toucher. Couvrez la chambre et laissez le solvant remonter les plaques par capillarité.

Lorsque le solvant a atteint le haut des plaques, retirez-les de la chambre et disposez-les en position debout dans la hotte jusqu’à ce que le solvant se soit évaporé. Une fois que les plaques sont sèches, vérifiez si des impuretés ont migré près du haut des plaques TLC. Ceux-ci apparaîtront sous la forme d’une bande jaune sous la lumière visible ou d’une bande fluorescente sous la lumière ultraviolette.

Si la majorité de la plaque a encore une teinte jaunâtre, répétez le processus de nettoyage dans la même chambre TLC en utilisant le même solvant. Après avoir retiré les plaques TLC de la chambre, jetez le solvant. Laissez le solvant résiduel s’évaporer complètement avant d’utiliser la chambre pour la partie suivante du protocole.

Ensuite, pour éliminer l’humidité résiduelle qui peut affecter la migration des composés sur la silice, calez les plaques à la verticale dans une étuve de séchage à 100 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes pour une plaque de 20 x 20 centimètres et cinq minutes pour des plaques de sept centimètres sur 10. Une fois les plaques sèches, laissez-les refroidir à température ambiante avant de les charger d’extraits. Pour préparer les chambres à la séparation de l’extrait, utilisez des ciseaux pour couper un morceau de papier filtre légèrement en dessous de la hauteur de la chambre et environ la moitié du périmètre de la chambre en largeur.

Ce papier agira comme une mèche pour aspirer les solvants vers le haut de la paroi de la chambre et saturer la chambre avec des papiers solvants, améliorant ainsi la reproductibilité des séparations. Dans une hotte, mélangez les solvants ici. Les solvants utilisés sont l’acétate d’éthyle, le méthanol, quatre à un volume par volume. Versez le mélange de solvants dans la chambre et couvrez.

À l’aide d’un crayon, marquez légèrement l’origine à un point de la plaque CCM qui se trouvera au-dessus de la surface du solvant en développement dans la chambre. Si l’absorbant de la plaque TLC est mou et s’endommage facilement, faites des marques sur les bords comme indiqué ici. Ensuite, dissolvez les extraits dans suffisamment de solvant organique pour obtenir une solution concentrée au lieu d’une suspension trouble.

Ici, le solvant utilisé est le méthanol. À l’aide de micro-pipettes capillaires ou d’une seringue d’un microlitre, les étalons et les échantillons sont chargés sous forme de bandes étroites tout en laissant une bordure d’un centimètre sur les côtés de la plaque, permettent aux bandes de sécher la plaque en avançant la plaque ou en la chargeant dans une hotte pour aider à sécher les bandes plus rapidement. Une fois les bandes sèches, chargez à nouveau les échantillons au même endroit ou sur place.

Si une plus grande concentration d’échantillon est nécessaire sur la plaque, répéter l’opération au besoin dans la chambre de CCM. Assurez-vous que toute la mèche est saturée de solvant. Ensuite, à l’aide d’une pince ou d’une pince, placez les plaques à l’intérieur de la chambre TLC.

Les plaques ne doivent pas toucher la mèche. Couvrez la chambre et laissez les plaques se développer avant que le front du solvant n’atteigne le haut de la plaque. Retirez les plaques du réservoir de CCM et marquez la hauteur de la façade du solvant avec un crayon.

Laissez sécher l’assiette. Dans une hotte, développez toutes les plaques CCM restantes dans la même chambre CCM, qui est généralement utilisable pendant une journée entière si elle est maintenue fermée. Si la quantité de solvant dans la chambre diminue sensiblement, préparez plus de mélange de solvants une fois les plaques sèches.

Visualisez les bandes sous lumière visible ou UV. Une chambre d’observation avec une lampe UV portable est pratique, surtout si la lampe peut détecter des composés à la fois à 254 nanomètres d’UV à ondes courtes et à 365 nanomètres d’UV à ondes longues. À l’aide d’un crayon, délimiter les bandes à l’aide d’un système de documentation photographique en gel équipé de lumières aériennes, UV et/ou visibles pour obtenir des images des plaques.

Enfin, pour faciliter la caractérisation des bandes, calculez le facteur de rétention ou les valeurs RF en mesurant d’abord la distance parcourue par le composé, puis en mesurant la distance parcourue par le solvant et en divisant le premier par l’échelle. Une fois que les emplacements des bandes ont été marqués, les plaques peuvent être stockées pour plus tard. Utilisation dans le cadre de l’essai biologique.

Enveloppez les assiettes dans du plastique et couvrez-les de papier d’aluminium. Conservez les assiettes à moins 20 degrés Celsius. La durée maximale de stockage dépend de la stabilité du composé car la silice n’est pas neutre.

Certains composés peuvent se dégrader lorsqu’ils se trouvent sur la plaque TLC. En préparation de l’essai de biographie de contact, préparer et inoculer des bactéries productrices d’hyperammoniac ou un milieu HAB dans des conditions anaérobies. La culture utilisée dans ce cas est Clostridium stickland eye strain sr.

Cultivez la culture jusqu’à la phase exponentielle ou stationnaire à 39 degrés Celsius. Utilisez des techniques anaérobies stériles lorsque vous travaillez avec des micro-organismes anaérobies. Préparez zéro point 75 % poids par volume.

L’agar-gélose dans le même milieu que celui utilisé pour faire pousser les bactéries après que la température de la gélose a diminué à moins de 60 degrés Celsius. Inoculez la gélose fondue avec 1 % de volume par volume de culture et mélangez doucement, placez-la immédiatement dans une chambre anaérobie et versez-la dans des boîtes de Pétri en plastique de 15 x 100 millimètres avec des ciseaux. Coupez la plaque CCM en zones contenant la ou les bandes d’intérêt.

À l’aide d’un sharpie, on marquait les côtés arrière des plaques. Placez une bande de CCM inutilisée sur une plaque de gélose comme témoin. Placez ensuite les bandes face cachée sur des plaques de gélose.

Incuber les plaques, côté agar vers le bas, dans la chambre anaérobie. Incubateur pendant 24 heures à 39 degrés Celsius avec pince. Retirez les bandes CCM des plaques de gélose pendant qu’elles sont dans la chambre anaérobie.

Ajouter du tétra oleum rouge goutte à goutte sur les surfaces des plaques de gélose. Laissez la couleur se développer pendant au moins 20 minutes. Lorsque la plaque de commande devient complètement rouge, retirez-la de la chambre anaérobie.

Clostridium stick Landi est une bactérie anaérobie, il commencera donc à perdre sa viabilité immédiatement après son retrait de la chambre anaérobie, mais la couleur est stable pendant plus de 24 heures. À l’aide d’un appareil photo numérique, photographiez les plaques sous la lumière visible sur un fond qui offre un contraste suffisant. Une couleur rouge vif sera observée lorsque des cellules vivantes sont colorées.

Les cellules mortes ne tachent pas. Des séparations représentatives de silice et de TLC d’extraits de trèfle rouge contenant des composés phénoliques sont présentées ici. La séparation dans l’acétate d’éthyle hexane neuf à un sur 8,5 centimètres a donné lieu à cinq bandes, dont une complètement résolue depuis l’origine.

Les étalons chargés étaient Formin, Bio, Canon A et Genine. Quatre bandes de cette plaque ont été appliquées sur des cultures avec Clostridium stick Landi, une bactérie ruminale produisant de l’hyper ammoniac pendant 24 heures et colorée au rouge tétra oleum comme décrit ici. L’incubation avec la bande un Bio Canon A et une partie de la bande deux quatre Monon nein sur gélose ensemencée par des bactéries a permis d’obtenir une zone d’inhibition bien définie.

Cependant, l’incubation du reste de la bande deux, ainsi que des bandes trois et quatre, n’a pas inhibé la croissance bactérienne. Ces résultats ont démontré que le biocanon A était inhibiteur pour voir la croissance des yeux épineux, mais que le Nein ne l’était pas. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la technique est flexible.

D’autres micro-organismes d’essai peuvent être utilisés à condition que les milieux appropriés soient choisis et que des contrôles soient inclus pour s’assurer que la chimie de séparation et la méthode de détection sont compatibles après cette procédure. D’autres techniques, comme la chromatographie liquide à haute performance et la spectrométrie de masse, peuvent être utilisées pour aider à caractériser les composés antimicrobiens identifiés dans un essai biologique.