Un modèle de souris pour l'inflammation chronique induite par pathogène sur les sites locaux et systémiques

L'objectif général du protocole suivant est d'examiner les effets d'une infection microbienne sur l'inflammation chronique in vivo à l'aide d'un modèle animal physiologiquement pertinent. Cela est réalisé en infectant oralement des souris par Porphyromonas gingivalis afin d'induire une inflammation chronique locale et systémique. L'IRM peut ensuite être utilisée pour mesurer la progression de l'inflammation systémique chez des animaux vivants, tandis que la perte osseuse inflammatoire locale est évaluée par micro-CT, et les plaques athéroscléreuses peuvent être visualisées par coloration des lipides en coupe après sacrifice.

En fin de compte, les différences de volume osseux alvéolaire et l'accumulation de plaques athéroscléreuses entre les souris infectées par P gingivalis et les témoins non infectés peuvent être mesurées respectivement par analyse en micro-TDM et par coloration des lipides sur coupes de tissu. Le principal avantage de notre modèle animal est qu'il permet d'examiner à la fois les mécanismes pathogènes et ceux de l'hôte impliqués dans l'inflammation chronique, notamment à des sites éloignés du foyer d'infection. Ainsi, il est possible d'analyser des sites systémiques ainsi que des sites locaux d'infection en utilisant des souris transgéniques et des mutants bactériens définis.

Ce modèle peut aider à identifier les aspects clés de la pathogénie, tels que les facteurs de l'hôte et microbiens contribuant à la maladie. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les mécanismes spécifiques de l'hôte et du pathogène impliqués dans la perte osseuse inflammatoire et l'athérosclérose, elle peut également être adaptée à d'autres modèles murins de maladies, notamment l'arthrite rhumatoïde, le diabète et le cancer. Il s'agit de la plateforme d'IRM à haut champ de l'Université de Boston, et mon postdoctorant Ning va démontrer certains aspects de l'imagerie chez la souris. Commencez par étaler des stocks congelés de peach gingivalis 3 81 sur des boîtes de gélose sanguine anaérobies, puis incubez les boîtes dans une chambre anaérobie à 37 degrés Celsius.

Après trois à cinq jours, utiliser les organismes cultivés sur la boîte pour ensemencer des cultures liquides de cinq millilitres de bouillon d'infusion cerveau-cœur, ou BHI. Après une croissance nocturne, transférer les cultures dans 45 millilitres de BHI et incuber les cultures anaérobiquement pendant 18 à 24 heures supplémentaires. En phase exponentielle moyenne, récolter les bactéries par centrifugation pendant 10 minutes à 7 000 ×g et à température ambiante, puis redisperser soigneusement le culot dans cinq millilitres de PBS à l’aide d’une pipette sérologique après avoir lavé le culot trois fois dans 50 millilitres de PBS. Resuspendre le culot dans du PBS de manière à ce qu’une dilution au 1/10 de la culture ait une densité optique de 1,0 à 660 nanomètres.

Ensuite, ajouter une quantité suffisante de carboxyméthylcellulose de viscosité moyenne pour obtenir une solution à 2 % poids/volume, puis ajouter lentement la carboxyéthylcellulose à la suspension bactérienne sous agitation vortex afin d'éviter les agrégats. Pour mesurer l'évolution de l'inflammation chez C deux. Placer d'abord un support pour animal, avec la tête de la souris en position supine, dans une sonde verticale de 30 millimètres et dans l'alésage vertical d'un scanner IRM 11,7 T.

Après les procédés de stabilisation et d'ajustage, utilisez une séquence rare pour acquérir des images de repérage selon trois orientations orthogonales afin de créer des images axiales, coronales et sagittales. Ensuite, après avoir utilisé une angiographie par résonance magnétique à faible résolution pour confirmer que les images acquises se situent bien dans la région cible, réalisez une angiographie par résonance magnétique à haute résolution de l'artère anonyme à l'aide d'une séquence d'écho de gradient 3D non synchronisée, en utilisant les paramètres suivants : une épaisseur de coupe de 1,5 centimètre, un angle de bascule de 45 degrés, un temps de répétition de 20 millisecondes, un temps d'écho de 2,2 millisecondes, un champ de vision de 1,5 × 1,5 × 1,5 centimètre, une matrice de 128 × 128 × 128 et un nombre de moyennes de quatre, pour un temps total d'acquisition d'environ 22 minutes.

Ensuite, sélectionnez une image axiale de l'artère désignée située entre 0,3 et 0,5 millimètre en dessous de la bifurcation sous-clavière pour l'analyse de la région d'intérêt (ROI). Épingler l'aorte en veillant à maintenir le tissu constamment recouvert de PBS. Commencez par positionner l'aorte en position anatomique, avec les bulbes de l'aorte à gauche. Placez ensuite des épingles de Mnuchin temporaires successivement aux cinq emplacements suivants : au sommet de l'aorte, sous la troisième branche de l'arc aortique, à mi-chemin de l'aorte descendante, près de l'extrémité inférieure de l'aorte descendante, et au-dessus de la branche de l'artère fémorale.

Ensuite, utilisez des ciseaux à ressort très fins pour découper le côté gauche de l'aorte en partant de la branche gauche de l'artère fémorale jusqu'au-dessous de la branche la plus basse de l'aorte ascendante. Puis, après avoir coupé et épinglé chaque branche afin d'exposer sa surface interne, continuez à épingler le tissu. Toute la surface interne est ainsi exposée, clairement visible par-dessus et dégagée de tout obstacle visuel causé par les épingles.

Pour colorer les lipides et quantifier les lésions, commencez par recouvrir l'aorte fixée avec une solution fraîchement préparée de Sudan IV ou de rouge d'huile O. Après 50 minutes, lavez le tissu avec de l'isopropanol à 70 % pendant une à cinq minutes, puis rincez délicatement l'aorte avec de l'eau doublement distillée jusqu'à ce que l'eau s'écoulant du tissu ne soit plus rouge. Ensuite, recouvrez l'aorte avec du PBS et placez une règle à côté du tissu pour faciliter l'étalonnage de l'image.

Ensuite, capturer des images du tissu à l’aide d’une caméra haute résolution fixée à un microscope stéréoscopique, en enregistrant les images au format TIFF. Enfin, à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, tracer manuellement chaque surface intime pour en déterminer la superficie. Puis, pour calculer la superficie des lésions à l’aide d’un seuil de couleur automatisé, définir un seuil pour chaque image afin de déterminer une intensité de couleur permettant de distinguer les lésions des zones normales.

Le pourcentage de la surface intime recouvert par des lésions athéroscléreuses peut ensuite être calculé dans cette expérience représentative réalisée avec des souris infectées par p gingivalis. Une analyse volumétrique a révélé que les souris infectées présentent une perte osseuse significative par rapport aux témoins non infectés. L'inspection visuelle de l'hémimaxillaire reconstruit illustre une augmentation de la surface exposée des racines des molaires chez les souris infectées par rapport aux témoins, dans un contexte prédisposant à l'athérosclérose.

Des souris déficientes en POE. P. gingivalis induit une inflammation chronique qui entraîne une perte osseuse alvéolaire et un dépôt de plaque inflammatoire au niveau du sinus aortique et d'une artère nominale dès 24 heures après la dernière infection, ce qui peut être surveillé chez des souris vivantes par imagerie par résonance magnétique in vivo en série à différents moments après l'infection, comme le montrent ces images représentatives. De plus, les mesures effectuées sur des coupes de l'aorte colorées au Sudan IV démontrent que l'infection par P. gingivalis augmente significativement le dépôt de lipides et l'étendue des lésions au niveau de la surface intima.

En outre, l'analyse immunohistochimique des lésions du sinus aortique révèle une infiltration accrue de macrophages et une expression élevée du récepteur immunitaire inné toll-like receptor two chez les souris infectées par les IVs. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prendre en compte les points temporels de la durée expérimentale auxquels l'inflammation est évaluée, qui doivent être adaptés à la progression de la maladie. Après l'imagerie par résonance magnétique, d'autres méthodes telles que la microscopie en face à face ou l'immunohistochimie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la charge athéroscléreuse globale ou les composants cellulaires de la lésion.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension d'un modèle murin in vivo, qui vous permet d'examiner à la fois les facteurs de l'hôte et les facteurs pathogènes impliqués dans l'inflammation chronique. N'oubliez pas que le travail avec des agents pathogènes peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles qu'une utilisation appropriée des EPI, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.