Méthodes pour caractériser spontanée et induite par Locomotion sursaut dans un modèle de la maladie de Parkinson induite de la roténone-de Drosophila

L’objectif global de l’expérience suivante est de déterminer la locomotion spontanée induite par le sursaut et à long terme dans un modèle de maladie de Parkinson induite par la roténone de la drosophile, ceci est réalisé en élevant la drosophile avec des aliments supplémentés en roténone pour induire le phénotype. Dans un deuxième temps, les mouches sont soumises à l’essai de réponse de sursaut et à un appareil à double flacon et à un essai de locomotion spontanée à long terme. Dans un moniteur d’activité de la drosophile, les résultats montrent que l’exposition à la roténone provoque des défauts de locomotion chez la drosophile sur la base de la quantification de la sursaut et de la locomotion spontanée à long terme.

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la drosophile, des modèles de troubles neurodégénératifs et de locomotion, tels que des défauts de locomotion induits par le sursaut et de la locomotion spontanée à long terme. Pour commencer, ajoutez 1,5 gramme de milieu de drosophile instantané. Dans un flacon anti-mouches standard, constituez le milieu avec cinq millilitres d’eau déminéralisée contenant la dose appropriée de roténone.

Ensuite, huit à 12 mouches mâles âgées d’un à trois jours utilisent du dioxyde de carbone et les transportent dans des flacons contenant le médicament. Les aliments supplémentés permettent aux mouches de récupérer de la sédation pendant 20 minutes avec le flacon en position horizontale. Ensuite, placez le flacon à la verticale dans un incubateur sombre et clair de 12 heures à 25 degrés Celsius pour le reste de l’expérience.

Ensuite, retournez un flacon anti-mouches standard sur un autre flacon et scellez le joint avec du ruban adhésif pour créer un appareil à double flacon. Divisez ensuite le flacon double en trois sections égales de 6,33 centimètres en marquant des cercles autour des flacons avec un marqueur permanent. Après trois jours d’exposition au médicament, transférez les mouches dans l’appareil à double flacon.

En replaçant le ruban adhésif sur la couture, les mouches s’acclimatent au nouvel environnement pendant 15 minutes. Placez ensuite les flacons sur un fond blanc et installez l’appareil photo numérique. Assurez-vous que l’ensemble de l’appareil est visible dans un seul cadre, que la fiole double et la minuterie sont bien en vue et que toutes les mouches sont nettes.

Marquez l’emplacement de la caméra et du flacon pour maintenir des images cohérentes entre les essais, affichez clairement le numéro de l’essai et le traitement médicamenteux dans la vue de la caméra. Ensuite, tapotez fermement l’appareil à double flacon contre le comptoir trois fois et assurez-vous que toutes les mouches tombent au fond du flacon et démarrez immédiatement la minuterie. Prenez une photo de l’appareil toutes les cinq secondes pendant une minute.

Laissez ensuite les mouches se rétablir sans être dérangées pendant une minute. Répétez le test deux fois de plus avec un temps de récupération d’une minute entre chaque essai. Examinez les photos et notez le nombre de mouches dans chaque section au fil du temps pour faire les calculs reconstituer trois grammes d’oph instantané, un milieu avec 15 millilitres d’eau désionisée et la dose appropriée de roténone.

Au bout de cinq minutes, placez soigneusement les tubes verticalement dans des flacons transparents et chargez la nourriture ferme d’un centimètre de haut en tournant le tube. Ensuite, poussez doucement le capuchon en plastique sur l’extrémité du tube, en évitant la création de bulles d’air Sedate. Un mâle d’un jour vole avec du dioxyde de carbone et insère soigneusement une mouche dans chaque tube avec un pinceau.

Branchez ensuite l’extrémité du tube avec une petite boule de coton. Laissez les mouches récupérer du dioxyde de carbone avec les tubes en position horizontale pendant 15 minutes et assurez-vous que toutes les mouches sont vivantes et actives. Insérez les tubes dans le moniteur d’activité de la drosophile ou DAM et vérifiez que tous les tubes sont dans la même position par rapport au DAM.

Placez le DAM dans un incubateur sombre et clair de 12 heures à 25 degrés Celsius. Ensuite, connectez le DAM au système de collecte de données. Ouvrez ensuite le logiciel DAM sous les préférences.

Sélectionnez une longueur de bac de 10 minutes pour commencer la collecte des données et autorisez le programme à collecter les données pendant sept jours. Ensuite, ouvrez le programme d’analyse de fichiers DAM et accédez aux données du moniteur en cliquant sur sélectionner les données d’entrée. Sélectionnez ensuite la plage de moniteur appropriée et réglez la longueur du bac sur des intervalles de 10 minutes.

Ensuite, dans le type de fichier de sortie, choisissez les fichiers de canal et laissez toutes les autres options par défaut. Cliquez ensuite sur analyser les données et enregistrez les fichiers dans un dossier désigné. Enfin, importez des données dans un logiciel d’analyse de données circadiennes pour obtenir des comptages par minute.

Après trois jours d’exposition à différentes doses de mouches de type sauvage de Canton, exposées à des doses accrues, ont montré une déficience de la réponse de sursaut. Un pourcentage plus faible de mouches se trouvait dans la partie supérieure et un pourcentage plus élevé dans la partie inférieure de l’appareil après 30 secondes, ce qui indique une déficience de la réponse sarale, une tendance similaire a été observée pour les mouches dans l’essai de locomotion spontanée. Le nombre de numérations par minute a été mesuré dans le moniteur d’activité de la drosophile ou DAM.

Le quatrième jour après l’exposition, les mouches exposées à 250 micromolaires et 500 micromolaires de roténone présentent une réduction significative du nombre de mouches par minute. Ces tests peuvent être facilement adaptés pour caractériser les défauts de locomotion dans d’autres modèles œsophagiens de maladie et l’efficacité des agents thérapeutiques.