Analyse de l'altération de l'épithélium Produit par Entamoeba histolytica Maladies infectieuses

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer les interactions précoces hôte-pathogène et le potentiel d’invasion de l’ATB. Histolytica. Préparez d’abord les trophozoïtes intacts, les trophozoïtes, les lysats totaux ou les trophozoïtes sécrétés. Ensuite, incubez les cellules épithéliales de l’hôte avec des concentrations appropriées des différents trophozoïtes.

Maintenant, à l’aide de l’immunofluorescence AM, analysez les cultures épithéliales traitées pour certaines protéines ABA histolytica qui interagissent avec les jonctions serrées des cellules épithéliales et mesurez également les altérations de la barrière paracellulaire par la résistance électrique trans-épithéliale. Pris ensemble, les résultats peuvent démontrer le désassemblage des jonctions serrées par TBA Histolytica, et également identifier la participation des complexes sélectionnés dans ce processus. Les principaux avantages de cette technique sont l’utilisation de différents produits du parasite pour évaluer la translocation des facteurs d’Eva histo dans l’épithélium de l’hôte, ainsi que pour démontrer la participation de ces eva.

Ses facteurs sur l’ouverture de la jonction de cellules entières au tout début de l’infection. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’amibie, telles que la compréhension des interactions moléculaires entre le parasite épithélial et le parasite divastique. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode éprouvent des difficultés parce qu’elles ne connaissent pas la proportion appropriée de temps d’incubation des deux cellules pour la co-incubation, ni comment obtenir les différents produits ELI et comment mesurer le TER.

Les implications de cette technique s’étendent à notre thérapie des amis, car ces facteurs vir tels que le complexe E-H-C-P-A-D-H 112 pourraient être exploités comme cibles dans de nouvelles stratégies de traitement. Quatre. Cette méthode in vitro peut donner un aperçu de la participation du facteur viral Anica dans l’interaction initiale du site hospitalier. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que l’inbivo, les modèles d’infection chez les souris hamster, les cochons guinés, ainsi que dans les biopsies intestinales humaines. Culture.

Les cellules MDCK dans 10 millilitres de média DMEM complété à 5 % de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius. Croissance authentique une fois 10 à la cinquième trophozoïtes de l’avent amibe histolytica dans 15 millilitres de TYIS 33, moyen à 37 degrés Celsius. Pour détacher les trophozoites, refroidissez le tube pendant cinq à 10 minutes dans un bain d’eau glacée.

Transférez ensuite la culture de manière aseptique dans un tube conique et centrifugez-la à 360 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Maintenant, décantez soigneusement le surnageant. Ajoutez du PBS glacé à la pastille et retournez le tube plusieurs fois pour disperser les cellules après la centrifugation.

Déterminez le nombre de trophozoïtes à l’aide d’un hémocytomètre pour lyser les trophozoïtes, congelez-les brusquement dans de l’azote liquide pendant une minute, décongelez à quatre degrés Celsius et agitez vigoureusement le vortex. Activez maintenant les protéases présentes dans les lysats avec 0,02 % de mercaptoéthanol bêta. Diluez neuf fois 10 pour les six trophozoïtes dans trois millilitres de PBS glacé et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres.

Placez maintenant la suspension tropho à un angle horizontal incliné de cinq degrés dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour recueillir les produits sécrétés, centrifugez le tube à 360 fois G pendant 10 minutes. À l’aide d’une seringue jetable et stérile, recueillir soigneusement le surnageant, en évitant ainsi la contamination des échantillons par les trophozoïtes de la pastille. Ensuite, pour éliminer toutes les cellules transférées, faites passer le surnageant à travers une membrane d’acétate de cellulose de 0,22 micron.

Activez maintenant les protéases avec 0,02 % de bêta-mercaptoéthanol pour la culture par immunofluorescence. Les cellules MDCK sur un couvercle en verre stérile se glissent dans une boîte de culture cellulaire à 24 puits multiples. Inspectez les cellules sur le microscope inversé jusqu’à ce qu’elles atteignent 100 % de confluence.

Ajoutez les différentes conditions des trophozoïtes dilués dans un millilitre de PBS chaud. Inclure les conditions de contrôle des cellules MDCK avec PBS et non e histolytica, ainsi que les cellules MDCK avec les différentes conditions des trophozoïtes, mais émettant une incubation avec des anticorps primaires. Placez la plaque de culture dans l’incubateur pendant deux ou 30 minutes.

Ensuite, lavez les cellules épithéliales cinq fois avec du PBS froid pour éliminer les molécules non liées ou trophozoites. Fixez et perméez les cellules avec un millilitre d’éthanol à 96 % pendant quelques minutes à moins 20 degrés Celsius dans une chambre humide. Retirez soigneusement les lamelles de couverture des puits.

Retirez l’excès de liquide du bord à l’aide de papier filtre et plongez la lamelle avec les cellules vers le bas dans une solution bloquante BSA à 0,5 %. Incuber les échantillons pendant une heure à température ambiante. Pendant ce temps, préparez un mélange d’anticorps primaires dans le PBS.

Soulevez les lamelles de la solution de blocage. Séchez tout excès de liquide sur du papier filtre. Transférez les cellules dans la solution d’anticorps et incubez les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Lavez les cellules cinq fois avec un millilitre de PBS pour éliminer les molécules non liées. Préparez maintenant un mélange des deux anticorps secondaires fluorescents dans le PBS. Incuber les échantillons dans des anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité pour la coloration nucléaire.

Incuber les cellules pendant trois minutes avec 200 microlitres de solution dappy de 0,05 millimolaire à température ambiante dans l’obscurité. Maintenant, analysez les préparations par microscopie confocale à travers des coupes de Zack et des plans XZ dans des expériences de co-incubation. À l’aide d’inhibiteurs de protéase ou d’un anticorps spécifique, incuber chaque condition expérimentale pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius avec des inhibiteurs de protéase ou une culture d’anticorps monoclonaux.

cellules MDCK sur des supports stériles perméables au transpuits dans le compartiment supérieur, placer 100 microlitres de suspension cellulaire et dans le compartiment inférieur, placer 600 microlitres de milieu DMEM supplémenté. Placez les filtres transwell préparés dans l’incubateur sur un microscope inversé. Vérifiez que les cellules sont confluentes à 100 %.

Recueillir et mettre en pool le milieu du compartiment supérieur de chaque puits à 50 microlitres de ce mélange de milieu. Ajoutez 50 microlitres de suspension de trophozoïtes ou de contrôle PBS. Transférez maintenant les mélanges dans la chambre supérieure de chaque transpuits contenant les cellules MDCK.

Trempez immédiatement les deux électrodes STX dans chaque puits pour mesurer la résistance électrique trans-épithéliale. Assurez-vous que l’électrode la plus longue touche le fond de la chambre inférieure et que l’électrode la plus courte est recouverte d’un fluide dans le compartiment supérieur. Les E histolytica ont été cultivés dans des conditions d’accent et récoltés à la fin de la phase logarithmique à la phase stationnaire précoce de la croissance.

Ici, le marqueur de jonction serrée zéro un a été utilisé pour visualiser les contacts cellulaires des cellules épithéliales qui sont stabilisées par des jonctions serrées et d’adhérence. L’immunofluorescence avec l’anticorps monoclonal a été utilisée pour étudier l’interaction du complexe dérivé de l’amibe avec l’application à la surface épithéliale de trophozoïtes, de trophozoïtes, de lysats totaux ou de produits sécrétés sur la monocouche épithéliale a entraîné une colocalisation du complexe avec jonction serrée. Après 30 minutes, une coloration discontinue au ZO s’est développée aux frontières des cellules et une internalisation dans les vésicules.

Cette perturbation était plus importante dans les contacts des cellules MDCK avec les trophozoïtes et les trophozoïtes. La microscopie laser confocale des lysats totaux a indiqué que le complexe de virulence pénétrait vers l’espace intercellulaire. La co-localisation avec le contact parasitaire perturbé ze O un colorant a perturbé la fonction de barrière épithéliale et a entraîné une baisse de 90 % de la résistance électrique trans-épithéliale.

La pré-incubation des trophozoïtes avec un anticorps contre le complexe ou avec des inhibiteurs de protéase a entraîné une protection contre la chute de TER prise. Ensemble. Ces données suggèrent que l’activité protéolytique et les propriétés adhésives sont des facteurs de virulence importants de ce complexe lors de l’invasion d’e histolytica. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser les mécanismes par lesquels EMBA histolytica viral dans les facteurs ouvrent des jonctions serrées au début de l’infection Lorsque maîtriser cette analyse des lésions épithéliales peut être effectuée en trois heures une fois que les produits lya et les cultures cellulaires sont prêts.

Lors de l’obtention de cette procédure, il est important de se rappeler de s’en tenir aux temps d’interaction exacts pour les ions Après cette procédure. D’autres méthodes telles que les tests d’immunoprécipitation peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les associations possibles entre enba, les facteurs de violence histolytiques et les protéines épithéliales après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des interactions alside pour explorer la pathogenèse de l’AMS chez les souris hamster, le cobaye et dans les tissus humains.