Les dosages biochimiques pour l'analyse des activités de l'ATP-dépendant remodelage de la chromatine enzymes

L’objectif de la procédure suivante est de mesurer les différentes activités biochimiques d’un complexe de remodelage de la chromatine dépendant du TP. Ceci est réalisé en mesurant un glissement dépendant de la TP d’un nucléosome de position d’une extrémité d’une molécule d’ADN à une position plus centrale sur l’ADN à l’aide d’un test de déplacement de mobilité électrophorétique ou emsa. Une méthode similaire basée sur l’EMSA peut être utilisée pour surveiller la formation de zones mononucléologiques liées aux complexes de remodelage afin d’évaluer l’activité de liaison aux nucléosomes des complexes de remodelage de la chromatine.

De plus, la chromatographie sur couche mince peut être utilisée pour mesurer l’activité APA d’un complexe de remodelage de la chromatine dépendant du TP. En fin de compte, ces méthodes peuvent être utilisées pour mesurer le remodelage de la chromatine dépendant de la TP des complexes humains dans l’O 80. Dans cette vidéo, nous allons faire la démonstration d’essais biochimiques étudiant les complexes de remodelage de la chromatine NO 80.

Une méthode similaire peut également être appliquée pour étudier d’autres complexes de remodelage de la chromatine ainsi que pour effectuer le test de remodelage des nucléosomes dépendant du TP. Préparez d’abord les substrats des nucléosomes après avoir mis en place une réaction PCR de 100 microlitres comme indiqué dans le tableau. Effectuez les réactions PCR dans un thermocycleur, puis faites passer les produits de réaction deux fois dans des colonnes de spin sans nucléases pour éliminer tous les nucléotides non incorporés.

Ensuite, mélangez deux fragments d’ADN 6 0 1 marqués au P 32 avec six microgrammes de nucléosomes hilaires dans 50 microlitres de tampon, et incubez le mélange à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, diluez séquentiellement le mélange à 0,8 molaire, 0,6 molaire et 0,4 molaire de chlorure de sodium par addition de 12,5 microlitres, 20,8 microlitres et 41,6 microlitres respectivement de solution tampon tris HCL complétée par E-D-T-A-P-M-S-F et DTT incuber pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius après chaque ajout, après la dernière incubation à 125 puis 250 microlitres du tampon de chlorhydrate tris. De plus, il est complété par du glycérol P 40 et du PSA en deux autres dilutions de 30 minutes et 30 degrés Celsius à 0,2 molaire et 0,1 molaire de chlorure de sodium respectivement.

Ensuite, stockez le substrat mononucléosome à quatre degrés Celsius jusqu’à trois mois avant de mettre en place les dosages de gels de polyacrylamide natif coulé. Ensuite, pour chaque réaction à effectuer, combinez environ 20 nanomolaires dans oh 80 avec la quantité appropriée de tampon EB 100 suffisante pour donner un volume de 4,75 microlitres dans un siliconé pré-réfrigéré. Le microtube à centrifuger de 1,5 millilitre permet de recongeler immédiatement tout NO 80 restant contenant des fractions, de la glace carbonique en poudre.

Ensuite, versez 5,25 microlitres de cocktail maître fraîchement préparé dans chaque tube de réaction, en mélangeant bien en pipetant de haut en bas. Ensuite, incubez les réactions dans un bloc de chaleur à 30 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajoutez 1,5 microlitre de mélange de retrait fraîchement préparé dans chaque tube pour terminer les réactions, puis mélangez chaque tube de réaction.

Eh bien, faites-les tourner et incubez-les à 30 degrés Celsius pendant encore 30 minutes. Pendant ce temps, pré-exécutez le gel de polyacrylamide natif dans une unité d’électrophorèse verticale à 100 volts pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, en utilisant 0,5 XTBE comme tampon de fonctionnement avec une barre d’agitation magnétique à l’intérieur de la chambre inférieure pour maintenir une circulation tampon constante à la fin de l’incubation avec retrait du mélange, mélangez 2,5 microlitres de matrice de chargement à chaque réaction. Et après un bref essorage, utilisez des pointes de chargement pour charger les échantillons sur le gel.

Faites fonctionner le gel à 200 volts pendant 4,5 heures à quatre degrés Celsius avec circulation tampon. Transférez ensuite le gel sur une pile de deux feuilles de papier filtre et déposez les filtres de papier avec le gel sur le dessus à l’aide d’une pellicule plastique transparente pour détecter le signal. Exposez le gel à un écran phospho de stockage à quatre degrés Celsius pendant la durée souhaitée, puis scannez l’écran avec un système de scanner d’imagerie isotopique et analysez les données à l’aide du logiciel approprié pour effectuer les dosages APA dépendants de l’ADN et des nucléosomes.

Commencez par combiner 10 à 50 nanomolaires des sous-complexes immuno-purifiés avec une quantité de tampon eeb 100 suffisante pour donner un volume de 2,2 microlitres dans un tube de micro-centrifugeuse lubrifié de 1,5 millilitre pré-refroidi pour chaque réaction, puis recongelez immédiatement toute fraction contenant du NO 80 dans de la glace carbonique en poudre. Ensuite, mélangez doucement 2,8 microlitres de sous-cocktail fraîchement préparé contenant des nucléosomes d’ADN ou aucun des deux dans les tubes réactionnels contenant des enzymes avec pipetage ascendant et descendant et transférez les tubes dans un bloc de chaleur à 30 degrés Celsius. Ensuite, utilisez un crayon pour tracer une ligne très légère à au moins 1,5 centimètre du bord inférieur d’un polyéthylène de 20 par 10.

Je veux dire chromatographie sur couche mince ou plaque TLC. Ensuite, placez 0,5 microlitre de chaque mélange réactionnel sur la ligne à 5, 15, 30 et 60 minutes après l’incubation, en ramenant immédiatement chaque échantillon dans le bloc thermique, de sorte que plusieurs points temporels peuvent être prélevés à partir d’un seul tube. Après avoir appliqué le dernier échantillon, utilisez un sèche-cheveux pour sécher la plaque, puis transférez la plaque dans une chambre en verre contenant suffisamment de liquide.

0,375 molaire de phosphate de potassium pour permettre aux 0,5 centimètre inférieurs de la plaque CCM d’être immergés dans la solution. Couvrez la chambre et développez la réaction jusqu’à ce que l’avant de la phase liquide atteigne le haut de la plaque TLC, après quoi la plaque doit être immédiatement séchée au sèche-cheveux et exposée à un écran phospho de stockage à température ambiante. Enfin, balayez l’écran à l’aide d’un système de scanner à imagerie isotopique pour déterminer la quantité radioactive d’un substrat TP et d’un produit DP.

Cette première expérience démontre que le complexe est purifié par le drapeau IES à deux drapeaux, N-O-A-T-E et le drapeau NO 80 delta N ont des activités de glissement nucléosomiques similaires, indiquant que l’extrémité N du NO 80 et/ou ses sous-unités associées sont dispensables pour le remodelage des nucléosomes par le complexe NO 80. En revanche, le complexe est purifié par l’indicateur NO 80 delta n delta HSA sont inactifs dans ce test, indiquant que l’activité de remodelage dépend du domaine HSA des APA NO 80 et/ou de ses sous-unités associées. En utilisant une modification de la procédure de dosage du glissement des nucléosomes, on peut mesurer l’activité de liaison des nucléosomes des complexes de remodelage de la chromatine.

Dans cette expérience, l’incubation des nucléosomes avec des quantités croissantes de complexes NO 80 intacts purifiés par la sous-unité NO 80 E a conduit à une disparition dose-dépendante de la bande correspondant aux zones mononucléologiques libres et à l’apparition d’une nouvelle espèce décalée qui a migré près du sommet du gel. En revanche, alors que les nucléosomes ont été incubés avec des complexes plus petits qui ont été purifiés par le delta N de NO 80 et qui manquaient d’un sous-ensemble de sous-unités de NO 80, les espèces déplacées ont migré plus rapidement, ce qui suggère que la mobilité relative de la bande super décalée est déterminée par la taille du test de complexes. Dans cette dernière expérience, les résultats d’un test comparant les activités de l’ADN et des APA activés par les NUCLÉOSOMES de deux sous-complexes différents de NO 80 sont présentés.

Les taches qui migrent le plus lentement correspondent à l’alpha 32 P de départ marqué TP, et les espèces qui migrent plus rapidement sont les produits de réaction A DP, les zones indiquant la direction de la migration du solvant. Lors de l’utilisation de ces procédures, il est important de se rappeler d’effectuer des tests dont la durée varie et qui contiennent différentes concentrations d’enzymes. Cela permettra de s’assurer que les mesures sont prises lorsque les courbes temps-réponse et dose-réponse du produit sont linéaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser les activités de liaison des nucléosomes et de glissement des nucléosomes des complexes de remodelage de la chromatine purifiés. N’oubliez pas que travailler avec des matières radioactives peut être dangereux. Il faut prendre des précautions comme porter une blouse de laboratoire et des lunettes de protection, surveiller la contamination radioactive et éliminer correctement les déchets radioactifs.