Évaluation complète de la lignée germinale toxicité chimique Utilisation du nématode Caenorhabditis elegans

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer de manière exhaustive la toxicité chimique germinale à l’aide du nématode C No Haitis elgan. Pour ce faire, on synchronise d’abord les vers en ajoutant une solution d’eau de Javel diluée à une population de vers à un stade mixte de la souche PXOL One GFP de C Elgan. Cette étape génère un grand nombre d’embryons protégés de l’eau de Javel par leur coquille d’œuf.

La deuxième étape consiste à générer une population synchronisée de larves de L one en laissant les embryons éclore dans un liquide sans nourriture. Ensuite, les vers atteignent leur quatrième stade larvaire ou L quatre, après quoi ils sont exposés aux produits chimiques d’intérêt dans un liquide pendant 65 heures. La dernière étape est la visualisation par microscopie à fluorescence de l’expression des rapporteurs de la GFP dans les embryons à l’intérieur de l’utérus des vers.

En fin de compte, la proportion d’embryons positifs à la GFP par rapport au témoin DMSO reflète l’antigénicité des composés testés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les modèles Rodin ou les tests de culture cellulaire, est que nous pouvons évaluer la génicité et la toxicité germinale des produits chimiques dans un modèle animal entier tout en effectuant un test à haut débit effectuant la procédure. Aujourd’hui sera la boursière postdoctorale Dr.Daniella Perotti.

Les vers graphiques pour cette procédure ont été préalablement préparés comme décrit dans le texte du protocole d’accompagnement, collectez les vers GR du milieu de croissance des nématodes ou des plaques NGM en les lavant avec un à deux millilitres de M neuf et en les transférant dans un tube conique de 15 millilitres. Laissez le ver GR sédimenter au fond du tube conique de 15 millilitres pendant environ cinq à 10 minutes. Ensuite, retirez le surnageant sans déranger la pastille de ver.

Transférez la pastille de vis sans fin dans deux à quatre micro-tubes de centrifugation et ajoutez un millilitre de solution d’eau de Javel diluée dans chaque tube. Incuber pendant deux à trois minutes à température ambiante. Surveillez la progression de la réaction au stéréomicroscope pour confirmer que tous les vers sont morts.

Ne pas blanchir plus de cinq minutes car les embryons pourraient mourir. Récupérez les vers par centrifusion pendant une minute. À 3000 tr/min.

Retirez le supernat et ajoutez un millilitre de M nine stérile pour neutraliser la réaction. Assurez-vous que tous les matériaux entrant en contact avec les vers après le traitement à l’eau de Javel sont stériles. Lavez les vers deux fois avec un média M neuf.

Retirez le surnageant et ajoutez M neuf à 100 à 200 microlitres. À l’aide d’une pipette de pâturage en verre, ajoutez une goutte du mélange Worm M nine pour dégager les plaques NGM et incubez-les pendant au moins 24 heures à 20 degrés Celsius pour permettre aux embryons d’éclore sans nourriture. La croissance des larves sera arrêtée à l’étape L Deux étapes de synchronisation.

Le blanchissement et la famine sont utilisés parce qu’il est crucial d’obtenir une population chaude hautement synchrone pour maximiser le nombre de larves L quatre qui seront utilisées pour l’exposition. Un jour après l’établissement d’une population synchronisée de larves de L one, prélever les larves de L one sur les plaques NGM transparentes. Lavez les plaques avec un à deux millilitres de M neuf et transférez les larves de L un dans un tube conique de 15 millilitres.

Laissez les vers adultes morts se déposer au fond du tube conique de 15 millilitres pendant environ cinq minutes. Récupérez le surnageant où se trouvent les vers L one dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Faites précipiter les vers par centrifusion pendant deux minutes à 2 600 tr/min.

Retirez le surnageant en laissant environ 500 microlitres. Déterminez la concentration de vers dans la solution M neuf en comptant le nombre de vers dans des gouttes de 10 microlitres. À l’aide d’un microscope stéréoscopique, comptez au moins cinq gouttes.

Ajustez la concentration des vers à 20 à 25 vers par microlitre dans M neuf, puis ajoutez 50 microlitres du mélange de vers M neuf dans les plaques NGM. Assis avec OP 50, les bactéries nourricières incubent pendant 65 heures à 15 degrés Celsius pour permettre à la population synchronisée L one de croître jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade L quatre. Ce criblage utilise une CL contre la souche qui contient un rapporteur transcriptionnel fluorescent pour détecter la perturbation de la lignée germinale et l’induction de l’aneuploïdie embryonnaire.

Prélevez les larves L quatre des plaques NGM transparentes en lavant les plaques avec un à deux millilitres de M neuf et en les transférant dans un tube conique de 15 millilitres. Laissez les quatre vers L sédimenter au fond du tube conique de 15 millilitres pendant environ cinq à 10 minutes. Retirez ensuite le surnageant sans déranger la pastille de ver.

Ajoutez trois à cinq millilitres de M neuf et déterminez la concentration de vers dans la solution M neuf en comptant le nombre de vers dans des gouttes de 10 microlitres. À l’aide d’un microscope stéréoscopique, comptez au moins cinq gouttes pour chaque échantillon. Remettez les vers en suspension à une concentration d’un vers par millilitre dans M neuf.

Diluez dix fois la bactérie OP 50 préalablement préparée avec M neuf. Assurez-vous que les bactéries remises en suspension atteignent la température ambiante, car les températures plus basses affectent le développement des vers à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez d’abord 100 microlitres du mélange de vers M neuf dans chaque puits d’une plaque à fond rond de 96 litres de deux millilitres de profondeur. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de bactéries OP 50 diluées dans chaque puits à la fin.

Chaque puits aura 100 vers dans 500 microlitres. Ajoutez 0,5 microlitre de la substance d’essai dans les puits souhaités pour obtenir une concentration finale de 100 micromolaires. Une concentration couramment utilisée dans les cribles chimiques dans le CL elgan expose les témoins de solvant à l’éthanol ou au DMSO à une concentration finale de 0,1 % en tant que témoin positif.

Utilisez 100 micromolaires sans cosol. Scellez la plaque à l’aide d’un film adhésif. Assurez-vous de bien sceller la plaque pour éviter la contamination croisée entre les puits.

Enveloppez l’assiette avec du papier d’aluminium. Transférez la plaque dans un agitateur de la température appropriée pendant une durée appropriée. Maintenez la température de la pièce autour de 20 degrés Celsius car la température affecte la croissance des vers à la fin de l’exposition aux produits chimiques dans l’agitateur.

Laissez reposer les plaques à 96 puits pendant 10 à 15 minutes pour permettre aux vers adultes de se sédimenter au fond de la plaque à l’aide d’une pipette multicanaux. Retirez 350 microlitres du M neuf de chaque puits en faisant attention de ne pas déranger les vers au fond de la plaque. Lavez les vers avec un millilitre de M neuf et laissez reposer à nouveau la plaque pendant 10 à 15 minutes pour permettre aux vers adultes de sédimenter au fond.

Retirez un millilitre de M nine de chaque puits en faisant très attention de ne pas déranger les vers au fond de la plaque. Resus, suspendez les vers dans les M neuf restants. Récupérez 100 microlitres du mélange de vers M neuf de la plaque de 96 puits et chargez-le dans les puits d’une plaque de puits de fond 384 à paroi noire.

Répétez le processus à l’aide de vis sans fin à partir de 4 plaques de 96 puits jusqu’à ce que tous les puits de la plaque de 384 puits aient été chargés. Il est important que tous les puits aient le même volume afin d’augmenter l’efficacité et la vitesse de l’autofocus pendant le processus d’acquisition d’images. Ensuite, ajoutez un microlitre de lale dans chaque puits et laissez les vers incuber pendant environ 30 minutes.

Lale agit comme un agoniste des récepteurs de l’acétylcholine et immobilise les vers, transfère la plaque vers un microscope à large champ à haut contenu capable de fournir une imagerie automatisée. Utilisez un logiciel d’acquisition et d’analyse d’images à haut contenu conformément aux directives du fabricant. Sélectionnez l’objectif quatre x pour acquérir une image par objectif.

Ajustez bien les paramètres d’imagerie GFP à 45 millisecondes d’exposition et la résolution d’image à 2160 par 2160. Les vers exposés sont directement imagés sur des plaques de 384 puits. Le nombre de vers contenant au moins un embryon positif à la GFP est compté pour chaque puits et normalisé par le nombre total de vers dans ce puits, comme indiqué ici.

L’exposition à des agents chimiques tels que le poison des microtubules AOL conduit à l’induction d’une forte proportion d’embryons exprimant la GFP par rapport au contrôle DMSO. Les embryons positifs à la GFP sont significativement plus brillants que la faible fluorescence de fond observée chez d’autres embryons, ainsi que l’autofluorescence observée dans l’intestin des animaux. La flèche rouge indique que les embryons positifs à la GFP sont clairement visibles dans l’utérus d’un ver traité AOL sans code.

Après cette procédure, d’autres méthodes peuvent être effectuées, telles que la coloration de l’ADN des vers afin d’obtenir un aperçu plus détaillé de l’effet des produits chimiques sur la lignée germinale. Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la toxicologie d’évaluer rapidement la toxicité pour la reproduction et la toxicité germinale des produits chimiques.