Mise en place d'épithéliales humaines Enteroids et Colonoids de tout le tissu et la biopsie

L’objectif global de cette procédure est de générer des entrées humaines à partir des tissus intestinaux. Ceci est accompli en disséquant d’abord la muqueuse intestinale du tissu sous-muqueux sous-jacent. La deuxième étape consiste à incuber la muqueuse avec de l’EDTA pour favoriser la dissociation de l’épithélium du tissu conjonctif.

Ensuite, les cryptes intestinales sont séparées de l’épithélium dissocié. Enfin, les cryptes intestinales sont cultivées dans une matrice membranaire basale. En fin de compte, des techniques d’immunohistochimie sont utilisées pour montrer l’organisation épithéliale ainsi que des marqueurs épithéliaux spécifiques des OID cultivés.

Les implications de cette méthode sont le fait que nous pouvons maintenant générer des OID à partir de biopsies spécifiques au patient, ce qui signifie que nous pouvons maintenant utiliser ce tissu en laboratoire pour examiner les maladies intestinales et les diagnostics, ce que nous n’avons jamais pu faire auparavant. Après avoir préparé les tampons et les réactifs, conformément au protocole textuel, décongelez la membrane basale sur de la glace et pré-incubez une plaque à 24 puits dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius lorsque le tissu a été reçu. Utilisez le PBS de KO sans calcium ni magnésium ni DPBS pour laver les tissus jusqu’à ce que le DPBS soit clair.

Placez le tissu dans une boîte de Pétri en verre recouverte de silicone remplie de DPBS glacé, avec le côté muqueux vers le haut et avec des épingles minucins, fixez le tissu en l’étirant et en l’épinglant. Ensuite, sous un microscope à dissection, utilisez des ciseaux de micro-dissection et une pince incurvée à pointe fine pour retirer la muqueuse sous-jacente de la sous-muqueuse et du tissu conjonctif. Ensuite, avec le côté muqueux vers le haut, étirez et épinglez la muqueuse disséquée à plat sur la boîte de Pétri en verre recouvert de silicone.

À l’aide d’une pince incurvée, grattez doucement la surface de la muqueuse. Cette étape est nécessaire pour améliorer la qualité de la préparation. Couvrez la muqueuse avec un tampon de chélation EDTA de deux millimolaires fraîchement préparé.

Ensuite, après avoir lavé le tissu sur de la glace, trois à quatre fois selon le protocole textuel sous un microscope à dissection, utilisez une pince incurvée pour gratter doucement la muqueuse afin de libérer les cryptes intestinales à l’aide d’une pipette. Retirez délicatement la suspension de la crypte de la boîte de Pétri et transférez-la dans un tube conique de 50 millilitres. Vérifiez ensuite le tissu pour vous assurer que presque toutes les cryptes ont été retirées de la muqueuse.

Filtrez la suspension de la crypte à travers un filtre de 150 micromètres deux fois et utilisez un microscope pour vérifier l’écoulement Après avoir lavé la suspension de la crypte et transféré le nombre de cryptes nécessaires dans un tube à fond rond de cinq millilitres, selon le protocole de texte, centrifugez la fraction de la crypte pendant 10 minutes à 150 G et quatre degrés Celsius. Retirez ensuite le surnageant à l’aide d’embouts de pipette pré-refroidis et de la matrice de membrane basale Resuspend. La pastille de la crypte.

Appliquez 50 microlitres de suspension de crypte dans la matrice de la membrane basale par puits sur la plaque de préchauffage en éjectant lentement la matrice de la membrane basale au centre du puits. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes pour permettre une polymérisation complète de la matrice de la membrane basale. Ensuite, superposez la matrice de la membrane basale avec 500 microlitres de mini intestin humain complet, complétés par 2,5 micromolaires chacun de CHIR 9 0 2 2 1.

Et Thien incube le tissu en changeant de milieu après deux jours, puis tous les deux jours par la suite. Cette figure montre un exemple typique de cryptes fraîchement isolées à partir de tissus entiers. Le nombre de cryptes isolées à partir d’une biopsie est plus faible que dans les tissus entiers.

Deux biopsies sont généralement effectuées en un seul passage. Chaque morsure de biopsie donne une surface de 10 millimètres carrés avec une moyenne de 50 à 100 crips par biopsie. Après une culture et une matrice de membrane basale pendant cinq à six jours, les Crips se rassemblent pour former des entérosphères pour l’intestin grêle et des colonosphères pour le côlon et sont évacués après sept jours.

Les intrants ou OID établis à partir des biopsies montrées ici subissent le même développement à une densité plus faible au moment de l’ensemencement. Par conséquent, l’emballage se fait généralement après 10 à 12 jours de culture. Comme le montre ici, les OID et les OID présentent un côté luminal et sont tapissés d’un épithélium.

Des cellules prolifératives peuvent être observées à l’intérieur des OID et sont situées à l’extrémité des bourgeons. L’imagerie confocale des OIDs colorés à la catrine e ici en vert montre les cellules épithéliales. Cette figure montre la croissance d’un patient atteint de mucoviscidose et d’une entéropathie par touffes due à une mutation congénitale du gène de la molécule d’adhésion des cellules épithéliales.

Le suivi de cette procédure ou d’une méthode telle que la PCR en temps réel ou le sang Western peut être utilisé pour répondre à une question supplémentaire concernant un gène ou un problème d’intérêt. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler systématiquement les Crips humains afin de pouvoir générer efficacement des entrées dans votre laboratoire pour répondre aux questions spécifiques de votre patient.