Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

L’objectif global de cette procédure est de fournir un test in vitro, semi-automatisé et tridimensionnel de l’invasion des cellules tumorales. Ceci est accompli en générant d’abord des stéroïdes tumoraux de taille reproductible en suspension dans une fixation ultra-faible autour du fond 96, des plaques de puits à la fois stéroïdes dans chaque puits. La deuxième étape consiste à retirer des parties du milieu et à ajouter une membrane basale comme une matrice ou un BMM directement à chaque puits pour fournir une matrice semi-solide dans laquelle les cellules tumorales envahissent le corps stéroïdien.

Ensuite, l’invasion tumorale de stéroïdes est surveillée à intervalles réguliers sur une période de 72 à 96 heures au cours de laquelle l’acquisition d’images est effectuée soit automatiquement sur un cytomètre, soit manuellement sur un microscope. La dernière étape consiste à analyser l’invasion des cellules tumorales à l’aide d’un cytomètre automatisé ou d’un logiciel d’imagerie. En fin de compte, le test d’invasion tumorale 3D de stéroïdes est utilisé pour modéliser l’invasion du cancer in vitro dans un format plus pertinent sur le plan physiologique et susceptible de cibler les études de validation et de criblage de médicaments.

Nous pensons que cette technique est complémentaire aux simples tests de prolifération cellulaire bidimensionnelle normalement utilisés pour la validation des cibles et le criblage de médicaments dans la recherche sur le cancer, car elle nous permet également d’étudier l’invasion, qui est un aspect clé de la progression du cancer dans un format tridimensionnel physiologiquement pertinent. J’ai d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque j’ai optimisé la tumeur 3D phe, la croissance sur microplaque. J’ai pensé qu’il serait bon d’utiliser la même configuration et le même regard sur l’invasion, et le résultat a été facile de retirer une partie du milieu de chaque puits et de la remplacer par la membrane basale comme la matrice.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car maintenir les stéroïdes dans une position centrale de chaque puits selon la tradition du BMM peut être difficile au début. Cela peut entraîner une analyse d’image sous-optimale en raison de la présence des stéroïdes dans des plans focaux différents. Avec de l’expérience.

Cela se produit rarement, mais si nécessaire, le processus peut être facilité par une centrifugation douce de la plaque. Pour commencer tous les BMM sur ICE pendant la nuit, conservez un ensemble d’embouts filtrants stériles pour les pipettes P 10, E 200 et P 1000 et les tubes stériles sont à moins 20 degrés Celsius. Placez également les plaques à 96 puits contenant des stéroïdes vieux de quatre jours sur de la glace.

À l’aide d’une pipette multicanaux, retirez délicatement 100 microlitres par puits de milieu de croissance des plaques de moineau. Pour ce pas, inclinez la pointe vers la paroi intérieure du fond en U. Bien en évitant le contact avec le fond du puits et l’emplacement du sphe.

Afin de minimiser la perturbation des stéroïdes à l’aide d’embouts glacés, transférez le BMM dans des tubes glacés. Pour l’invasion induite par les cytokines ou pour les études d’évaluation de médicaments, ajoutez des réactifs au BMM à l’aide d’embouts glacés. Par exemple, utilisez le facteur de croissance épidermique ou EGF pour stimuler l’invasion des cellules du carcinome épidermoïde Cal S et cal r.

Ensuite, versez doucement 100 microlitres de BMM dans l’ubo. Bien diriger la pointe vers la paroi intérieure du puits. Cette étape est la plus critique.

En ce qui concerne l’analyse d’image optique, les stéroïdes doivent rester au centre du bien. Répétez cette étape pour tous les puits requis, en autorisant cinq à six répétitions par condition. Si nécessaire, passez à une pointe fraîchement réfrigérée à l’aide d’une aiguille stérile.

Retirez les bulles si présentes. Utilisez un microscope pour vérifier visuellement que les stéroïdes sont en position centrale s’ils ne sont pas centrifugés, centrifugez la plaque à 300 fois G pendant trois minutes de quatre degrés Celsius. Cela garantira que les stéroïdes sont situés au centre de chaque puits.

Ensuite, transférez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et laissez le BMM se solidifier une heure plus tard. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez délicatement 100 microlitres par puits de croissance complète. Études d’invasion ou d’évaluation de médicaments induites par des milieux ou des cytokines.

Inclure des cytokines ou des inhibiteurs dans le milieu pour l’acquisition automatisée d’images. Balayez les plaques sur le cytomètre à intervalles réguliers. À partir du temps zéro, sélectionnez l’application de confluence.

Vérifiez ensuite que le stéroïde est net. Si nécessaire, ajustez la mise au point manuellement et corrigez le décalage de mise au point. Sous les paramètres d’échantillonnage.

Le sélecteur scanne un champ de vision central. Après l’ajout de BMM, les stéroïdes tumoraux auraient dû rester en position centrale. Il n’est donc pas nécessaire de scanner l’ensemble du puits dans le logiciel.

Définissez les puits à scanner en les mettant en surbrillance sur la carte des plaques. Cliquez ensuite sur démarrer l’analyse. Pour l’analyse d’image automatisée, sélectionnez l’application de confluence.

Dans l’onglet d’analyse, ajustez les paramètres de l’application pour produire une segmentation précise autour du stéroïde, y compris les processus cellulaires et les podes envahisseurs s’étendant dans le BMM. Ajustez les paramètres pour chaque lignée cellulaire tumorale et/ou à différents moments. Vérifiez que les paramètres d’analyse sont appropriés pour les autres stéroïdes dans la plaque en cliquant sur quelques puits différents.

Si la segmentation ne décrit pas avec précision un stéroïde, ajustez davantage les paramètres de l’application. Cliquez sur démarrer l’analyse dans l’onglet résultats. Vérifiez plusieurs puits pour vérifier la qualité de l’analyse avant d’exporter les données au niveau du puits vers un tableur.

Répétez l’analyse pour tous les points temporels, puis calculez le pourcentage moyen de confluence pour les puits répétés et l’invasion en fonction du temps dans un graphique à barres. À l’aide d’un logiciel de graphiques scientifiques et de statistiques de choix pour l’acquisition manuelle d’images, utilisez un microscope inversé équipé de l’objectif 10 x pour enregistrer une image pour chaque stéroïde tumoral à intervalles réguliers. En commençant par T, on obtient zéro après que T est égal à entre 72 et 96 heures.

En fonction de la vitesse d’invasion de la muqueuse cellulaire en question, utilisez un objectif Forex lorsqu’une zone envahie est trop grande pour être complètement capturée dans le champ de vision 10 x. Enregistrez chaque image individuelle acquise pour l’analyse manuelle des images. Ouvrez les images du graphique de l’étape dans l’analyse d’imagerie.

Le logiciel de choix pour l’étalonnage est la prise d’images d’un graphique de scène. En utilisant à la fois des objectifs 10 x et quatre x. Entrez les mesures graphiques, les unités et les objectifs utilisés et effectuez l’étalonnage.

Cette étape n’est requise qu’une seule fois pour l’analyse d’image ultérieure. Il suffit de recharger les paramètres d’étalonnage requis. Ensuite, ouvrez les images du test d’invasion et sélectionnez les paramètres d’étalonnage en fonction de l’objectif du microscope utilisé pour obtenir les images.

Mesurez la zone couverte par les stéroïdes dans le logiciel utilisé ici. Allez dans mesurer et sélectionnez la taille du compte. Choisissez les paramètres de chargement pendant puis sélectionnez les paramètres de test prédéterminés.

Choisissez ensuite count. Le stéroïde doit ensuite être segmenté avec précision. Les mesures d’exportation sont des paramètres différents d’une feuille de calcul et enregistrent les informations d’image pertinentes sur la feuille de calcul.

Enfin, tracez la surface moyenne des stéroïdes répliqués ou de l’invasion en fonction du temps à l’aide de graphiques scientifiques et de logiciels statistiques. Montré ici comme un exemple d’invasion de cellules cancéreuses observée dans la lignée cellulaire de glioblastome U 87 MG, qui peut être utilisé pour illustrer l’invasion d’une tumeur cérébrale. Une fois intégré dans des cellules BMM étalées avec un modèle d’invasion typique en étoile, le processus est suivi sur une période de 72 heures.

Analyse d’image entièrement automatisée. L’utilisation d’un cytomètre d’image permet une segmentation autour des protubérances cellulaires et permet une quantification précise de l’invasion des cellules tumorales. Notez que pour cette lignée cellulaire, le corps stéroïdien est exclu de la mesure de la zone envahie.

L’analyse d’images entièrement automatisée est facile à réaliser et permet de quantifier l’invasion des cellules tumorales au fil du temps. Un schéma différent d’invasion cellulaire est présenté par l’isogénie humain squameux, isogénique de la tête et du cou. Les lignées cellulaires cancéreuses Cal S sont sensibles aux inhibiteurs de tyrosine kinase EG FFR et CAL R est résistante.

En l’absence d’EGF, aucune des deux lignées cellulaires n’a envahi le BMM en présence de protubérances en forme de doigt EGF, extrudées du corps principal des stéroïdes californiens. Alors que les cellules de Cal étaient moins invasives après 72 heures, les images dans ce cas ont été acquises rapidement à l’aide d’un cytomètre d’image et, pour illustrer une méthode alternative, le degré d’invasion a été quantifié manuellement à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images autonome. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que chaque lignée cellulaire doit être optimisée pour sa capacité à former des stéroïdes, la densité d’ensemencement cellulaire, la composition de la matrice et les paramètres d’image et d’analyse Suite à cette procédure. La même méthode qui pourrait également être adaptée pour évaluer une invasion tissulaire en 3D en utilisant, par exemple, les tumeurs en co-culture avec des corps embryonnaires pour ressembler à un tissu complexe ou d’autres organoïdes comme les astrocytes pour les gliomes ou les cultures cryptiques pour les cancers gastro-intestinaux, ou le foie pour le carcinome hépatocellulaire et les métastases du cancer du côlon.