En Vivo Dynamique de la rétine microglial activation cours neurodégénérescence: confocale ophtalmoscopique Imaging and Cell Morphometry dans Souris glaucome

L’objectif général de l’expérience suivante est de caractériser la dynamique microgliale dans un modèle murin de glaucome chronique par imagerie confocale in vivo de la rétine. Ceci est réalisé par une ophtalmoscopie confocale mensuelle non invasive ou CSLO pour visualiser la microglie fluorescente sur la rétine et la tête du nerf optique. L’analyse d’images en direct à l’aide de la segmentation SOMA des cellules basée sur le seuil et du morpho quantifie les changements dans le nombre et l’activation des cellules microgliales.

Les résultats montrent que l’imagerie mensuelle CSLO chez des souris vivantes peut être utilisée pour surveiller la cinétique de la distribution de la densité des cellules microgliales et l’activation morphologique au cours de la progression précoce de la neurodégénérescence chronique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’imagerie confocale à deux photons du cerveau d’une souris microgliale GFP positive est que l’imagerie CSLO de la rétine permet l’observation et la surveillance directes des cellules microgliales tout au long de la progression des troubles neurodégénératifs du vieillissement dans l’organisme intact. J’ai d’abord eu l’idée de cette méthode après que nous ayons démontré exvivo, que la microglie présentait une activation et un regroupement intenses dans la préparation centrale des jeunes DBA à travers des souris J à des âges qui précédaient la neurodégénérescence détectable.

Afin de se demander si ces changements immunitaires innés précoces qui ont précédé le glaucome détectable ont causé sa neurodégénérescence, nous avons dû établir une approche in vivo pour suivre les changements microgliaux. La démonstration de la procédure d’acquisition d’images en direct sera faite par Caesar Romero, un technicien de mon laboratoire. Pour commencer les opérations, démarrez le système CSLO et entrez les informations de la session. Ensuite, préparez-vous à l’imagerie en toute sécurité.

Fixez un objectif grand champ de 55 degrés propre. Placez une souris sur la plate-forme d’imagerie deux minutes après avoir administré l’anesthésique et dilatez les deux pupilles à l’aide de mes gouttes tatiques. Cinq minutes plus tard, vérifiez que la souris est anesthésiée.

Ensuite, en utilisant une pression minimale, couvrez chaque œil avec des lentilles de contact. Orientez la souris de manière à ce que l’œil droit rencontre l’objectif et que l’orbite soit parallèle à l’objectif. L’animal n’a pas besoin d’être attaché mais maintenu à une distance constante de la lentille de l’objectif.

Avec l’œil aligné avec lui pendant les 10 à 15 prochaines minutes, la souris ne bougera pas et ne clignera pas des yeux pendant que ses mouvements oculaires sont suivis par le système d’imagerie en direct CSLO. Commencez la séance d’imagerie en prélevant une vue du fond d’œil de la rétine interne. Pour cela.

Sélectionnez le mode infrarouge, qui correspond à une longueur d’onde d’excitation de 820 nanomètres. Ajustez ensuite la puissance du laser à 100 % et la sensibilité entre 40 et 60 %Ensuite, en travaillant à grande vitesse, localisez l’œil à l’aide du joystick pour orienter l’ophtalmoscope et préparez-vous à recueillir une vue du fond d’œil du disque optique et du système vasculaire rétinien. Inspectez la cornée et le cristallin à la recherche de blessures ou d’opacité.

Exclure de l’étude les yeux présentant des défauts ou des blessures susceptibles d’affecter l’acquisition de l’image. Maintenant, en rapprochant l’objectif de l’œil, localisez la zone du disque optique, qui est la surface de la tête du nerf optique ou ONH. Centrez ensuite l’image sur l’ONH.

Le positionnement correct de l’ONH est essentiel pour obtenir une mise au point et une mission uniformes sur l’ensemble de l’image. L’étape suivante consiste à visualiser les plans internes de la rétine ainsi que l’ONH. Pour un plan focal de référence, utilisez les principaux vaisseaux sanguins situés sur la surface vitréenne de la rétine, ce qui correspond à 59 et 60 dioptries, ou encore plus profondément à 55 dioptries dans les zones de disques optiques excavés.

Ensuite, ajustez la saturation de l’image à l’aide du bouton de l’écran tactile jusqu’à ce qu’un halo d’éclairage blanc couvre la majeure partie du fond d’œil autour du disque optique. Sélectionnez ensuite la saturation la plus basse qui rend un halo uniforme indiquant un contraste optimal pour cet œil. Il peut être nécessaire de réaligner l’appareil photo si les zones sombres persistent.

Maintenant, collectez une image haute résolution du fond d’œil de la rétine centrale en faisant la moyenne de 30 images prises en temps réel pour améliorer le rapport signal/bruit. Cela correspond à 4,7 images par seconde, normalisées immédiatement et à la même position préparées pour collecter une image de fluorescence des cellules GFP positives. Passez en mode d’imagerie par fluorescence sur l’écran tactile, qui sélectionne le laser bleu avec une excitation laser de 488 nanomètres et un ensemble de filtres barrière de 460 à 490 nanomètres, puis règle l’acquisition sur une puissance laser de 100 % et une sensibilité de 100 à 125 %.

Maintenant, collectez une image de fluorescence bidimensionnelle d’un seul point XY de l’ONH avec une moyenne de 100 x balayages. Ensuite, capturez une image multipoint de la rétine autour du composite ONH select dans le panneau de commande, puis effectuez un panoramique avec l’ophtalmoscope sur l’axe temporal nasal. Le logiciel calcule automatiquement la moyenne des zones nouvellement numérisées et les assemble en temps réel.

Si la qualité d’image des zones de la rétine est insuffisante pour permettre de calculer la moyenne, le cercle vert qui identifie une zone numérisée deviendra rouge. L’image composite résultante couvre une zone allant jusqu’à 1,7 par quatre millimètres. Des précautions doivent être prises lors de l’acquisition de l’image composite.

Les images à haute résolution peuvent être perdues en déplaçant l’objectif trop rapidement avant la fin de la moyenne de numérisation et de l’assemblage de l’image. Lorsque l’anesthésie commence à s’estomper, la séance d’imagerie doit se terminer car la souris commence à respirer fortement et l’imagerie devient impraticable. Commencez par aligner séquentiellement les images du fond d’œil pour une série chronologique en utilisant le système vasculaire et le disque optique comme points de repère.

À l’aide d’un logiciel de retouche d’image conventionnel, alignez toutes les images jusqu’à ce qu’elles se chevauchent. L’image du haut sera semi-transparente lors du déplacement. Ensuite, faites pivoter chaque image de la séquence jusqu’à ce que ses principaux vaisseaux sanguins se chevauchent avec le système vasculaire de l’image précédente et enregistrez la disposition pour référence future.

Enregistrez l’angle corrigé pour chaque image et appliquez-le à l’image de fluorescence à point XY unique correspondante. Il est maintenant possible d’identifier des cellules microgliales individuelles positives à la GFP localisées dans la rétine centrale en ouvrant les fichiers TIFF alignés dans le rendu Fluor. Pour visualiser toutes les cellules, remplissez l’écran avec l’image et définissez la vue de rendu composite orthogonale et interpolée.

Définissez ensuite les propriétés 0.58 gamma 255 point de saturation 255 luminance 195 alpha à 1.00 shading. Terminez les sélections en choisissant les deux canaux RG comme visibles. Masquez le canal B en double-cliquant dessus dans le cadre de l’espace de travail pour segmenter des cellules individuelles.

Sélectionnez et seuilz le canal rouge en augmentant le seuil bas jusqu’à ce que la majorité des cellules soient masquées avec un chevauchement minimal et en excluant les processus cellulaires tout en maintenant le seuil élevé constant. Enfin, enregistrez le fichier avec des cellules masquées à l’aide de la commande capture. Ouvrez l’image avec des cellules masquées dans l’éditeur de graphiques matriciels.

Inversez l’échelle de gris pour une observation directe et ajustez la résolution à 300 DPI ou plus. L’image RVB est enregistrée sous forme de fichier TIF. L’étape suivante de l’analyse d’images en direct est la segmentation microgliale, donc la segmentation et le morpho pour identifier SATA pour la quantification de zone.

Utilisez un logiciel capable de mesurer l’intensité et de compter les objets en fonction du seuil. Ouvrez le fichier TIFF avec des cellules segmentées et sélectionnez la redimensionnement de la spline pour une résolution maximale et le canal rouge en noir et blanc pour une meilleure visualisation. Ensuite, calibrez l’image en définissant son diamètre horizontal comme étant de 1,4 à 1,7 millimètre selon l’âge pour segmenter les cellules individuelles.

Donc, MA, appliquez le seuillage d’intensité sur le canal rouge. Ouvrez la fonction d’intensité de seuil sous la commande de mise à jour du nombre d’objets et du compte. Utilisez cette fonction pour suivre les paramètres bidimensionnels pour chaque seuil de région d’intérêt représentant un individu.

Ensuite, définissez le seuil d’intensité dans l’histogramme d’intensité. Sélectionnez les 50 à 60 % les plus bas des 255 niveaux et affinez la valeur de seuil finale des cellules individuelles. Évaluez visuellement le chevauchement entre le masque de couleur de seuil en bleu et le périmètre de la cellule soma en gris à l’aide des commandes de la barre d’outils binaire ou du catalogue d’objets.

Identifiez manuellement les régions sommales d’intérêt avec plusieurs cellules. Séparez ces éléments en séparant les régions d’intérêt. Ce faisant, utilisez la bascule pour visualiser directement les cellules maintenant en utilisant la restriction de zone.

Classez les cellules microgliales comme activées. Si leurs surfaces de somata sont supérieures à 50 à 60 microns carrés. Classez les microglies comme désactivées si elles ont des somates plus petits.

Enfin, vérifiez le processus et vérifiez la complexité de la ramification dans chaque cellule microgliale activée en superposant le masque somal et l’image du point XY unique avec le contraste augmenté de 50 %. Le protocole décrit a été utilisé pour visualiser les cellules microgliales sur une grande zone de la rétine centrale. Chez les jeunes souris DBA deux souris J hétérozygotes exprimant CX trois C une GFP, la haute résolution cellulaire combinée à l’image en direct, au seuillage et à l’analyse morphométrique a permis une segmentation automatique des cellules GFP positives individuelles, et donc les cellules sont discriminées en fonction de la zone DBA deux souris J modélisent le glaucome chronique et ont été imagées mensuellement pour surveiller le développement de la micro gliose locale et l’activation de la microglie à des âges précédant une neurodégénérescence détectable compatible avec la variable Progression de la neurodégénérescence dans les yeux individuels. Cette analyse a révélé des changements dans l’activation de la microglie rétinienne et la microgliose avec le temps.

L’analyse a également détecté des changements dynamiques dans la densité de la microglie totale et activée dans les rétines individuelles. La densité de la population de microglie n’était pas couplée à des changements dans la densité cellulaire exprimant la GFP conformément à d’autres résultats. Ainsi, l’analyse CSLO pourrait être utilisée comme indicateur de la progression précoce de la maladie.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser soigneusement les niveaux de saturation de l’image fluorescente de la GFP plus la microglie, localisée la rétine interne, la reproductibilité des images CSLO de la rétine centrale, ainsi que les détails cellulaires cohérents détectés sur la rétine centrale dépendent de manière critique de cette étape. Ce protocole d’imagerie en direct est appliqué dans notre laboratoire, ce qui permet d’établir un lien potentiel entre les changements précoces de la microglie de la tête du rétin et du neur optique, et la progression ultérieure du glaucome dans l’AD vers la JM et dans d’autres modèles de dégénérescence rétinienne chronique. Cette stratégie d’imagerie en direct peut également permettre la détection précoce d’autres pathologies chroniques qui ciblent également la rétine et le nerf optique pour la dégénérescence, telles que la sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson.