Un modèle de tissu 3D Poumon humain pour les études fonctionnelles sur Mycobacterium tuberculosis Infection

L’objectif global de cette procédure est de construire un modèle de tissu pulmonaire in vitro pour les études de l’infection à M tuberculosis. Ceci est accompli en superposant d’abord une matrice de collagène de fibroblaste sur le filtre d’un insert de plaque de culture cellulaire. Dans un deuxième temps, les cellules immunitaires et épithéliales pulmonaires infectées sont assises sur la couche de collagène des fibroblastes.

Le modèle tissulaire 3D résultant est ensuite exposé à l’air pour faciliter la sécrétion de mucus et la stratification de l’épithélium. Dans la dernière étape, le tissu est récolté et monté. En fin de compte, la microscopie d’immunofluorescence est utilisée pour analyser la formation d’un granulome précoce induit par M tuberculos.

Le principal avantage de cette technique ou des méthodes existantes, telles que la monocouche de cellules in vitro, est que les cellules de ce système sont présentes dans un microenvironnement 3D, permettant la formation de granulomes lors de l’infection par des microbactéries virulentes ressemblant à la tuberculose humaine Pour préparer des fibroblastes intégrés dans le collagène, commencez par traiter les cellules fibroblastiques pulmonaires avec tripsin pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius lorsque les cellules se sont détachées, Arrêtez la réaction avec huit millilitres de DMEM complet, puis faites tourner les cellules. Remettez les granulés en suspension à 230 000 cellules par millilitre dans du dmm frais et placez les cellules sur de la glace. Ensuite, ajoutez un insert par puits dans un six.

Assiette et distribution d’un millilitre d’un mélange de couche cellulaire fraîchement préparé dans chaque insert, en veillant à ce que le mélange recouvre tout l’insert sans aucune bulle d’air. Placez ensuite l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, mélangez deux millilitres de collagène avec 615 microlitres de prémélange dans un tube conique stérile sur de la glace pour neutraliser le pH du collagène par insert.

Ajoutez ensuite 58 microlitres de DMEM complet et 327 microlitres de fibroblastes pulmonaires par insert au mélange de collagène. Pipetage de haut en bas pour répartir uniformément les cellules dans tout le mélange. Ajoutez maintenant rapidement trois millilitres de la couche cellulaire sur le côté de chaque insert sur chaque couche de collagène acellulaire.

En prenant soin d’éviter les bulles d’air et remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant encore deux heures. Après la polymérisation du collagène, ajoutez deux millilitres de DMEM complet au fond de chaque puits et remettez la plaque dans l’incubateur pendant encore 24 heures. Le lendemain, à l’aide d’une paire de pinces propres, soulevez délicatement les inserts un par un et aspirez le milieu de culture par le bas de chacun.

Ajoutez ensuite deux millilitres de DMM complet au fond de chaque puits et deux millilitres de DMM complet à chaque insert. Changer les deux volumes de support tous les deux jours pendant cinq à sept jours. Pour préparer les macrophages infectés, il faut commencer par incuber une culture de macrophages pendant quatre heures avec une infection virulente de M tuberculosis à une multiplicité d’infection de 10.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules trois fois avec du PBS pour éliminer les bactéries extracellulaires et traitez les macrophages avec deux millimolaires, A DTA pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont détachées, suspendez-les dans un DMM complet sans antibiotique. Ensuite, aspirez tout le milieu de la plaque de matrice de collagène fibroblastique et ajoutez 1,5 millilitre de DMM complet frais et sans antibiotique dans les chambres extérieures.

Ensuite, mélangez des monocytes marqués par fluorescence avec les macrophages infectés dans un rapport de cinq pour un dans 50 microlitres de DM EM complet sans antibiotique par insert. Ajoutez ensuite 50 microlitres du mélange de macrophages monocytaires à l’intérieur de chaque insert et remettez la plaque dans l’incubateur. Au bout d’une heure, ajoutez lentement deux millilitres de culture, faites descendre les parois des inserts pour éviter de déloger les cellules et incubez les cultures pendant encore 24 heures.

Pour ensemencer les cultures avec des cellules épithéliales pulmonaires, ajoutez 4 millions de cellules épithéliales par millilitre dans 50 microlitres de dmm complet sur les matrices de collagène des fibroblastes des cellules immunitaires. Incuber les cellules pendant deux minutes à température ambiante, suivies d’une heure à 37 degrés Celsius. Ajoutez ensuite doucement deux millilitres de DMM complet sans antibiotique dans les inserts comme nous venons de le démontrer, et cultivez les cellules pendant trois jours supplémentaires.

Cinq jours après l’ensemencement, les macrophages infectés aspirent tout le milieu de culture de la plaque et ajoutent 1,8 millilitre de DMM complet sans antibiotique dans les chambres extérieures. Ensuite, l’air a exposé les modèles de tissus 3D dans l’incubateur pendant deux jours sans ajouter de support à l’insert le septième jour. Après l’ensemencement.

Retirez entièrement le milieu de la plaque et mélangez les modèles de tissu avec 4 % de paraldéhyde pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, séparez les membranes des inserts de puits. Ensuite, utilisez un scalpel propre pour retirer soigneusement les côtés des modèles de tissus et coupez chaque tissu en quatre morceaux carrés de taille à peu près égale.

Transférez les morceaux sur des lames de verre super frosts et laissez-les sécher pendant cinq minutes. Ensuite, à l’aide d’un montage fluorescent, un support contenant anti-décoloration et dpi, montez les mouchoirs et couvrez-les de lamelles. Laissez les lames à température ambiante dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient sèches, puis scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles.

Lorsque la laque est sèche, plongez les lames dans de l’éthanol à 70 % pour un transfert hors de l’installation BSL trois. Pour visualiser les tissus, acquérez des images 3D de cinq à 10 champs différents couvrant l’ensemble du morceau de tissu à une résolution de 512 par 512, Zack couvrant une épaisseur minimale de 20 microns avec une séparation d’un à 1,5 micron entre les piles sur un microscope confocal fluorescent pour la quantification 3D des amas de cellules. Ouvrez le logiciel de traitement d’images 3D et chargez l’image qui vous intéresse.

Ensuite, à l’aide de l’outil de réglage de l’affichage, ajustez chaque canal pour l’image, le contraste, la luminosité et l’opacité du mélange afin d’optimiser le rendu du volume et de minimiser les interférences de bruit. Ensuite, pour visualiser la surface du tissu, sélectionnez le canal des monocytes rouges et définissez les seuils appropriés à l’aide des filtres pour restreindre la sélection des monocytes rouges ou pour exclure l’arrière-plan si nécessaire. Enfin, exportez les données dans le tableur approprié pour une analyse ultérieure en aval.

Le septième jour, la microscopie confocale d’ensemencement de cellules post-infection par la tuberculose M révèle un regroupement de monocytes rouges au site de l’infection, comme le note la présence de la bactérie verte imitant les lésions de la tuberculose humaine connue sous le nom de granulome 3D. La visualisation offre la flexibilité d’interagir, d’examiner et de quantifier plusieurs caractéristiques. Une image 3D, par exemple, dans ces images représentant un amas de monocytes sur le site de l’em tuberculose.

La disposition spatiale des bactéries vertes et des amas de monocytes rouges peut être observée à partir des vues apicale, rotationnelle et latérale. Comme prévu, ces grappes n’ont pas été observées dans les tissus non infectés. La quantification de la taille et du nombre de monocytes, d’amas de cellules et de tissus infectés par M tuberculosis a révélé que la taille des amas de cellules est augmentée tandis que le nombre de monocytes individuels est diminué par rapport aux modèles de tissus non infectés.

Les utilisateurs potentiels de ce modèle de tissu pulmonaire comprennent une étude du rôle de différentes cellules immunitaires et de l’immunité tissulaire dans la tuberculose, l’étude des phénotypes de mycobactéries et l’essai de candidats médicaments qui tuent les mycobactéries dans le granulome.