Rapid In Situ Hybridation utilisant sondes oligonucléotidiques sur Brain Paraformaldéhyde préfixée de rats avec syndrome sérotoninergique

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une hybridation rapide en C deux sur du tissu cérébral préfixé à l’aldéhyde paraforme. Ceci est accompli en déshydratant d’abord des sections de tissu cérébral et en traitant les sections avec un, deux et trois réactifs de prétraitement. La deuxième étape consiste à hybrider les sections avec des sondes d’oligonucléotides primaires, puis des deuxième, troisième et quatrième sondes.

Ensuite, ajoutez un substrat rouge rapide pour détecter l’ARN cible. La dernière étape consiste à quantifier le niveau des signaux d’ARNm à l’aide du logiciel Image J. En fin de compte, les changements dans l’expression des gènes de l’ARN peuvent être obtenus en comparant les groupes expérimentaux et témoins.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle est relativement simple, peu coûteuse, reproductible et qu’elle prend moins de deux jours. Ce travail a été développé par moi-même et John Jay Lenan de l’école de médecine vétérinaire de l’Université Ross et Jean Soza et RU Tao de la faculté de médecine de la Florida Atlantic University. Dans le cadre de cette procédure, elle prélève quatre lames dans des boîtes de lames de microscope stockées dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Attribuez les sections aux tests P-P-I-B-D-A-P-B et HT deux gènes A, marquez-les et étiquetez-les avec un stylo à bille. Ensuite, immergez les lames dans de l’alcool à 100 % à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, séchez les lames pendant cinq minutes dans la hotte pour pipette de prétraitement 20 microlitres du prétraitement un réactif à chaque section, placez les lames sur un rail de rack dans un bac à humidité.

Secouez doucement le plateau d’humidité sur un shaker horizontal à basse vitesse pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les lames deux fois avec de l’eau distillée deux fois pendant deux minutes. Immergez les lames dans un bécher de 1000 millilitres contenant 450 millilitres de réactifs de prétraitement.

Ensuite, faites bouillir les lames pendant un total de cinq minutes à 100 degrés Celsius pour restaurer la structure de l’ARN. Après cela, lavez les lames deux fois avec de l’eau distillée deux fois pendant deux minutes à chaque fois. Placez les lames dans de l’alcool à 100 % pendant cinq minutes.

Ensuite, séchez les lames pendant cinq minutes. Dans la hotte, utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle autour de la zone sélectionnée dans la section du tissu. Ensuite, pipetez 10 microlitres de trois réactifs de prétraitement à chaque zone sélectionnée pour augmenter la pénétration de la sonde et couvrez le bac d’humidité avec un couvercle.

Ensuite, placez la plaque dans le four d’hybridation équipé d’un agitateur horizontal. Réglez la température du four à 40 degrés Celsius et secouez doucement la plaque pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les lames deux fois avec de l’eau distillée deux fois pendant deux minutes à chaque fois. Dans cette étape, pipetez 10 microlitres de sonde P-P-I-B-D-A-P-B ou HTR deux A sur les zones sélectionnées.

Couvrez ensuite le bac à humidité avec un couvercle pour éviter l’évaporation du réactif. Secouez doucement les lames sur l’agitateur horizontal à basse vitesse tout en les incubant à 40 degrés Celsius dans le four pendant deux heures. Ensuite, lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes à chaque fois, pipetez 10 microlitres de l’amplification un réactif sur chaque zone sélectionnée.

Secouez et incubez les lames à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes à chaque fois, pipetez 10 microlitres de l’amplification deux réactifs sur chaque zone sélectionnée. Secouez et incubez les lames à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Après cela, lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes. À chaque fois, pipetez 10 microlitres de l’amplification trois réactifs sur chaque zone sélectionnée. Secouez et incubez les lames à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes. Pipette de 10 microlitres de l’amplification quatre réactifs sur chaque zone sélectionnée. Secouez et incubez les lames à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes. Pipette de 10 microlitres de l’amplification cinq réactifs sur chaque zone sélectionnée. Secouez et incubez les lames à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes. Pipette de 10 microlitres du réactif d’amplification six sur chaque zone sélectionnée. Secouez et incubez les lames à température ambiante pendant 15 minutes.

Ensuite, lavez à nouveau les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes à chaque fois. Maintenant, pipetez 10 microlitres du réactif rouge sur chaque zone sélectionnée, placez les lames dans le bac à humidité sur l’agitateur horizontal à température ambiante et agitez doucement à basse vitesse pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les lames deux fois avec de l’eau distillée deux fois pendant 10 minutes.

À chaque fois, séchez les lames à 60 degrés Celsius au four pendant 15 minutes. Après cela, placez les lames de xylène dans la hotte pendant cinq minutes. Ensuite, pipetez 20 microlitres de support de montage à base de xylène sur chaque zone sélectionnée et recouvrez d’une lamelle.

Dans cette étape, faites glisser et déposez le fichier image dans la fenêtre principale de l’image J. Allez dans la barre de menu et sélectionnez image. Ensuite, sélectionnez le type dans le menu déroulant et sélectionnez huit bits.

Ensuite, sélectionnez ajuster puis sélectionnez seuil pour ouvrir la boîte de dialogue. Ajustez la valeur de la barre inférieure dans la boîte de dialogue afin que l’arrière-plan indésirable soit supprimé. Allez dans la barre de menu et sélectionnez Analyser, puis sélectionnez Analyser les particules pour ouvrir une deuxième boîte de dialogue.

Réglez la taille des particules sur 10. Ensuite, sélectionnez afficher les contours, puis afficher les résultats et résumer les cases. Enfin, cliquez sur OK pour afficher les données de particules dans les boîtes de dialogue.

Pour le calcul de la feuille de calcul, entrez les données dans la feuille Excel et faites la moyenne du nombre de particules dans le groupe salin comme référence. Calculez ensuite le niveau en pourcentage de chaque section et créez un graphique en conséquence. Voici les vues microscopiques claires des signaux d’hybridation indiqués par les points rouges.

Les tissus ont été préfixés avec de l’aldéhyde paraforme chez des rats profondément anesthésiés préalablement traités avec une solution saline et de la MDMA. Les sondes oligonucléotidiques utilisées sont D-A-P-B-P-P-I-B, et HT deux A.Cette figure montre l’effet sur l’expression hypothalamique du gène HT deux A chez des rats précédemment traités avec de la MDMA et une réduction de 20 % de l’expression de HT deux, une a a été observée. Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine des neurosciences de mesurer plus facilement l’expression génique du messager Ra en utilisant la paraformation in situ, le tissu cérébral préfixé en hauteur.