Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel

L’objectif global de cette procédure est de détecter la quantité d’un ARNm spécifique à partir de cellules tumorales dans le poumon, comme méthode d’analyse des métastases. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une mesure quantitative des métastases. Pour effectuer un curage ganglionnaire de tumeur pulmonaire, après avoir euthanasié une souris à l’aide d’une dose létale d’isofluorine selon le protocole de texte, placez la souris sur une planche de mousse sur son dos avec les membres écartés, et utilisez des broches de dissection pour la fixer à la planche.

Après avoir utilisé de l’éthanol pour pulvériser la souris, utilisez des pinces pour saisir la partie inférieure de l’animal au centre, et avec des ciseaux, coupez vers le haut vers le cou à travers la peau, en faisant attention de ne pas percer la cavité péritonéale de la souris. Maintenant, saisissez le péritoine à l’extrémité inférieure de l’animal et commencez à couper vers le haut vers la base du cou. Coupez soigneusement le long des côtés gauche et droit de la cage thoracique, en prenant soin de ne pas sectionner les vaisseaux sanguins qui pourraient saigner dans la cavité thoracique.

Retirez les os des côtes en coupant à gauche et à droite, à travers le diaphragme et les parties supérieures de la cage thoracique. Ensuite, à l’aide d’une pince, saisissez la trachée de la souris et tirez vers l’avant, et utilisez des ciseaux de dissection pour sectionner la trachée avant de retirer les poumons de la souris. Utilisez le PBS pour laver doucement le tissu pulmonaire.

Ensuite, après une évaluation grossière du tissu pulmonaire selon le protocole textuel, si les poumons doivent être analysés immédiatement, procédez à l’isolement de l’ARN. Pour isoler l’ARN du tissu, commencez par homogénéiser le tissu à l’aide de l’une des méthodes énumérées dans le protocole textuel. Préparez un tampon de lyse à partir d’un kit d’isolement d’ARN et ajoutez 20 microlitres de captoéthanol tumoral à chaque millilitre de tampon de lyse.

Remettez en suspension tous les 30 grammes de tissu dans 300 microlitres de tampon de lyse, et avec un sonicateur réglé à 30 % d’amplitude, sonicez le tissu pendant 10 secondes. Ajoutez 10 microlitres de protinase K à 590 microlitres de tampon TE, et ajoutez 600 microlitres de tampon à 300 microlitres de tissu soniqué. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes.

Ensuite, centrifugez les échantillons à une fréquence supérieure ou égale à 13 000 fois G pendant 10 minutes pour éliminer les débris. Transférez ensuite le surnageant dans de nouveaux tubes. Ajoutez 450 microlitres d’éthanol à 900 microlitres de surnageant pour précipiter l’ARN.

Transférez ensuite 700 microlitres du mélange d’éthanol lysat dans une colonne d’ARN. Tournez à nouveau à une fréquence supérieure ou égale à 13 000 fois G pendant une minute pour lier l’ARN à la colonne. Ensuite, jetez les déchets liquides, ajoutez le surnageant restant dans la colonne, puis tournez à nouveau.

Ensuite, ajoutez 350 microlitres de tampon de lavage dans la partie supérieure de la colonne et centrifugez les échantillons pendant 30 secondes. Jetez les déchets liquides et replacez la colonne dans le tube. Préparez la DNase en mélangeant cinq unités de DNase, une enzyme avec cinq microlitres de tampon 10X DNase et 40 microlitres d’eau libre DNase RNase pour chaque échantillon.

Ajoutez 50 microlitres de mélange DNase dans chaque colonne et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Ajoutez ensuite 350 microlitres de tampon de lavage dans les colonnes et centrifugez les échantillons pendant 30 secondes. Après avoir jeté la solution de déchets, ajoutez 600 microlitres de tampon de lavage deux et essorez pendant 30 secondes supplémentaires.

Jetez le liquide avant d’ajouter 250 microlitres de tampon de lavage deux, puis essorez pendant deux minutes. Transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte et ajoutez 50 à 100 microlitres d’eau libre RNase DNase dans la colonne. Après avoir incubé pendant une minute, tournez pendant une minute.

Relancez l’éluat collecté dans la colonne pour augmenter le rendement en ARN. Pour une utilisation immédiate, conservez les échantillons sur de la glace. Pour une utilisation ultérieure, congelez-le sur de la glace sèche ou de l’azote liquide et conservez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

À l’aide d’un spectrophotomètre, quantifiez l’ARN. Ensuite, dans des tubes ou des plaques stériles de PCR sans RNase DNase, utilisez 0,5 à 2 microgrammes d’ARN total pour préparer le mélange réactionnel pour la première transsynthèse, comme indiqué dans ce tableau. Mélangez, centrifugez doucement et programmez une machine PCR standard à l’aide du programme présenté ici.

Lorsque la réaction est terminée, utilisez de l’eau stérile sans nucléases pour diluer la réaction finie au volume souhaité. Pour effectuer une PCR en temps réel, utilisez un contrôle positif de l’ADN C, tel que HER2 humain, pour établir une courbe standard pour chaque ensemble d’amorces en préparant une à quatre dilutions en série de l’ADN C pour générer cinq standards. Ensuite, calculez le nombre total d’échantillons, qui doit inclure la courbe standard et les échantillons expérimentaux.

Ensuite, dans des tubes stériles libres de RNase DNase, préparez un mélange maître pour chaque gène expérimental d’intérêt, ainsi qu’un contrôle interne, tel que gapdh. Préparez une plaque d’essai contenant un microlitre de C DNase pour chaque échantillon étalon ou expérimental. Allouer au moins un échantillon d’ADN C par puits, pour chaque sonde d’amorce.

Ajouter 19 microlitres de mastermix par puits, pour chaque sonde d’amorce. Cette expérience de bioluminescence démontre que les poumons de souris traités avec ACT1, qui cible la protéine de jonction lacunaire Connexin 43, semblent négatifs pour l’activité de la luciférase, suggérant l’absence de cellules tumorales dans le tissu. Cependant, l’analyse des sections H&E du tissu pulmonaire montre des micrométastases qui n’ont pas été éclairées par la luciférase, ce qui suggère que l’imagerie de la luciférase n’est pas assez sensible pour détecter un faible nombre de cellules tumorales.

Voici les résultats d’une expérience de qRT-PCR, à l’aide d’une sonde spécifique de HER2, pour détecter les cellules tumorales humaines HER2 plus JIMT1 dans le tissu pulmonaire à partir de cellules initialement transplantées dans le coussinet adipeux à mémoire de souris Bien qu’aucune métastase visiblement visible n’ait été observée sur les poumons, dans deux des 11 échantillons, la qRT-PCR a détecté des métastases. Dans cette figure, une analyse de courbe standard a été préparée pour déterminer les niveaux relatifs de HER2 normalisés à la gapdh pulmonaire de souris dans une série de numéros de cellules.

Les résultats indiquent que la qRT-PCR, à l’aide de la sonde HER2, était suffisamment sensible pour détecter les niveaux de HER2 dans aussi peu que 10 cellules. Enfin, cette analyse de régression montre le nombre relatif de cellules dans chaque échantillon de poumon, y compris les témoins positifs et négatifs. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à huit heures, si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de prendre des précautions pour maintenir l’intégrité de l’ARN pendant l’isolement de l’ARN et la réaction de transcriptase inverse. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter les métastases dans le tissu pulmonaire entier, par PCR quantitative en temps réel.