Bactérienne Feuille Infiltration Essai de caractérisation fine des réponses de défense des plantes à l'aide du Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystème

L’objectif global de cette procédure est de caractériser quantitativement la réponse immunitaire d’Arabidopsis diliana grâce à un test d’infiltration optimisé à la seringue. Ceci est accompli en utilisant d’abord l’infiltration de seringue pour livrer manuellement des bactéries dans la feuille à travers les ouvertures naturelles appelées sada. La deuxième étape consiste à obtenir des disques de tissu foliaire infecté après le développement des symptômes de la maladie.

Ensuite, les bactéries sont extraites des disques foliaires par homogénéisation à haut débit. La dernière étape est la dilution en série et le repérage sur des plaques de comptage bactérien pour dénombrer les colonies. En fin de compte, la croissance bactérienne à l’intérieur de chaque feuille peut être corrélée à la force relative de la réponse immunitaire de la plante.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunité des plantes, telles que l’identification des gènes qui contribuent aux réponses de défense contre le stress biotique. Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode existante est qu’elle permet une quantification précise de la croissance des agents pathogènes dans les tissus végétaux infectés et permet d’éviter les erreurs expérimentales causées par l’échantillonnage de feuilles ayant un état de développement variable. Cette méthode peut fournir des informations sur la réponse immunitaire de la plante à une infection par un agent pathogène bactérien virulent, et elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que l’acide salicylique ou les réponses immunitaires déclenchées par des motifs moléculaires associés à des microbes.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à introduire la bactérie dans la feuille sans endommager les tissus. La démonstration de la procédure suivante sera faite par des chercheurs postdoctoraux hindous et des étudiants diplômés shalu et yali. Bientôt de mon laboratoire, le test pour une sensibilité accrue aux maladies sera démontré dans cette vidéo.

Avant l’expérience, préparez des plaques de milieu King B ou KB, faites un litre de milieu solide KB comme décrit dans le texte du protocole et laissez-le refroidir sur une plaque d’agitation magnétique. Lorsque le support est refroidi pour toucher à 80 % de glycérol, une molaire, du sulfate de magnésium et de la streptomycine versent dans le média deux tailles différentes de plaques de média KB. La boîte de Pétri, plus petite, sert de plaque de culture bactérienne primaire et la boîte de Pétri plus grande sert de plaque de comptage des bactéries.

Conservez les plaques à quatre degrés Celsius deux jours avant la série de dosage. PSM ES 43 26. Les bactéries d’un stock de glycérol négatif de 80 degrés Celsius sur une plaque de culture de bactéries streptococciques KB et incubent à 28 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures le lendemain.

Amorcez la culture liquide dans un tube à essai stérile avec quatre millilitres de milieu liquide kb contenant 50 microgrammes par millilitre de streptomycine. Secouez une boîte de 250 tr/min à 28 degrés Celsius pendant la nuit. Les plantes d’Arabidopsis pour l’expérience sont cultivées dans des conditions détaillées dans le texte du protocole le jour même où la culture bactérienne liquide est initiée.

Marquez les pétales des feuilles numéro cinq et six avec un marqueur émoussé et imperméable pour faciliter l’identification des tissus infectés lors de l’échantillonnage. Pour améliorer l’ouverture du STA et faciliter l’entrée de la solution pathogène dans l’eau foliaire. Les plantes bien en trempant le plat par le bas pendant 20 minutes.

Au bout de 20 minutes, égouttez l’excès d’eau. L’infection des plantes d’arabidopsis est effectuée. Le lendemain de l’initiation de la culture liquide.

Transférez la culture bactérienne dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre et faites-la tourner à 9 600 G pendant deux minutes. À température ambiante, jetez le surnageant et remplacez en suspension la pastille bactérienne avec un millilitre de chlorure de magnésium stérile de 10 millimolaires, diluez la suspension de bactéries avec neuf millilitres de chlorure de magnésium de 10 millimolaires dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Après avoir mesuré la densité optique des bactéries, diluez les bactéries avec 10 millimolaires de chlorure de magnésium jusqu’à un DO final de 600 de 0,0002.

Pour le test d’infection EDS. Une seringue sans aiguille à bout émoussé d’un millilitre, communément appelée seringue à insuline, est utilisée pour l’infiltration. Remplissez la seringue avec 0,5 à 0,6 millilitres de la solution bactérienne diluée pour un meilleur contrôle pendant le processus d’infiltration, ne remplissez pas la seringue à sa pleine capacité.

Exposez la surface inférieure de la feuille sur le dessus de l’index, puis à l’aide du pouce, ajustez doucement la position de la feuille. Positionnez la seringue verticalement contre la surface de la feuille pour assurer une répartition uniforme de la pression afin de réduire les dommages aux feuilles. Essayez d’éviter la zone de la nervure médiane lors de l’infiltration.

Poussez lentement le piston pour infiltrer la solution bactérienne. L’entrée de liquide dans le mésophylle de la feuille sera visualisée comme l’indique la couleur plus foncée de la feuille, s’infiltrera sur toute la surface de la feuille même si cela nécessite plusieurs tentatives. Une fois l’infiltration terminée, épongez doucement la feuille avec un tissu absorbant pour éliminer la solution pathogène supplémentaire.

Inspectez visuellement le tissu foliaire infecté pour détecter tout dommage. Laissez sécher les plantes infiltrées pendant une à deux heures, remettez les plantes dans leurs conditions de croissance d’origine. Vaporisez un dôme transparent avec de l’eau et couvrez les plantes infectées pendant deux heures.

Ensuite, fissurez le dôme pour générer une ouverture de deux à trois pouces et laissez-le agir pendant le reste de l’expérience d’infection, qui dure généralement trois jours. Un jour avant de quantifier la croissance des agents pathogènes. Préséchez les plaques de support KB de 150 millimètres sur 15 millimètres.

Séchez les plaques en les gardant à température ambiante pendant environ 24 heures. Traiter le tissu infecté après l’émergence de la sclérose indiquée par le jaunissement du tissu infecté dans les génotypes sensibles, mais avant le développement de lésions nécrotiques. Pour chaque génotype, préparez six tubes de broyage.

Placez une boule de broyage en acier inoxydable et ajoutez 500 microlitres de chlorure de magnésium stérile de 10 millimolaires dans chaque tube. Ensuite, détachez la feuille infectée de la plante et perforez un disque de feuille avec une perforatrice à papier à un trou à l’aide d’une pince au hasard, placez deux disques de feuilles de deux plantes différentes dans chaque tube de broyage. Scellez les tubes, homogénéisez le tissu avec un homogénéisateur à haut débit à vitesse maximale pendant 10 minutes.

Répétez ce processus si nécessaire jusqu’à ce que le tissu soit bien homogénéisé et que les solutions deviennent vertes en raison de la libération de chlorophylle par les feuilles infectées pendant l’attente. Pour l’homogénéisation, remplissez chaque puits dans les six premières rangées d’une plaque de culture de 96 puits avec 180 microlitres de chlorure de magnésium de 10 millimolaires. Transférez 20 microlitres de suspension de tissu broyé dans chaque puits de la première rangée de la plaque à 96 puits et mélangez en pipetant le liquide à plusieurs reprises de haut en bas.

Si de petits fragments de tissu obstruent l’extrémité, coupez-la de deux à trois millimètres pour aider à acquérir le bon volume de solution afin de fournir suffisamment d’espace pour que la gouttelette sur le dessus de la plaque espace les tissus de différents génotypes en rangées alternatives. Pour préparer une dilution en série de dix fois, transférez 20 microlitres de suspension tissulaire dans la deuxième rangée et répétez cette procédure jusqu’à la sixième dilution. À l’aide d’embouts de pipette divisés, transférez 20 microlitres de la solution de la plaque murale 96 sur la plaque KB de 150 millimètres sur 15 millimètres.

Travaillez de la suspension la plus diluée à la plus concentrée, il n’est donc pas nécessaire de changer les pointes de pipette entre les dilutions. Séchez la plaque à température ambiante avec le couvercle fissuré. Une fois qu’il n’y a plus de liquide à la surface de la plaque, fermez le couvercle et incubez la plaque à température ambiante.

Incuber les plaques pendant 40 à 60 heures jusqu’à ce que les colonies deviennent visibles. Confirmez que les bactéries sur les plaques décuplent le prévisible. Baisse des unités formant des colonies.

Comptez les bactéries avant qu’elles ne prolifèrent et que les colonies ne fusionnent. Déterminez le nombre de bactéries dans la dilution la plus faible qui n’a pas de colonies qui se chevauchent. Habituellement, la dilution préférée à compter contiendra entre 10 et 50 colonies, et elle peut varier entre les répétitions techniques.

Pour calculer les niveaux de prolifération bactérienne, il faut déterminer le nombre d’unités formant colonies par disque foliaire à l’aide de la formule suivante : R est le numéro de la rangée et T est le nombre de bactéries dans chaque répétition technique. Les données sont ensuite utilisées pour produire un graphique. Chaque point de données est représenté par la moyenne de six répétitions techniques sur une échelle logarithmique.

Les aérobares représentent l’intervalle de confiance à 95 % de la maladie aggravée moyenne. La sensibilité au P-S-M-E-S 43 26 a été évaluée par l’infection par un inoculum avec une DO 600 de 0,0002. Les résultats montrent que les mutants très sensibles NPR one dash one ont environ 2,5 log ou 300 fois plus de croissance pathogène que les plantes sauvages Columbia zero.

Le test d’infiltration à la seringue peut être modifié pour évaluer différentes couches de la réponse immunitaire. Pour évaluer l’immunité déclenchée par l’acide salicylique, l’application externe de salicylate de sodium est utilisée pour déclencher la réponse immunitaire, qui est quantifiée par la croissance des agents pathogènes. La perte de NPR R one, qui fonctionne comme le récepteur de l’acide salicylique et la corégulation transcriptionnelle majeure des gènes cibles dépendants de l’acide salicylique, conduit à une insensibilité à l’application exogène du dérivé de l’acide salicylique.

Pour caractériser l’immunité déclenchée par des motifs moléculaires associés aux microbes, les plantes ont été prétraitées avec deux déclencheurs connus. FLAG 22 et L 18, les plantes sauvages de type Columbia zero traitées par FLAG 22 ont entraîné une réduction d’un log ou de 10 fois la population bactérienne, tandis que les deux plantes mutantes FLS n’ont pas réussi à déclencher l’effet de restriction de la croissance bactérienne. De même, les plantes mutantes EFR étaient insensibles au prétraitement L 18.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier la réponse immunitaire arabe opsys grâce au test d’infiltration à la seringue. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de surveiller le développement de la maladie et d’échantillonner les tissus après l’émergence du corsis. Le pseudomona pather cul cola S phos 3, 2 6 est un pathogène hémi-atrophique.

Ainsi, le prélèvement doit être effectué avant le passage au stade neurotrophique. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR quantitative en temps réel et l’analyse sanguine occidentale peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la voie de signalisation immunitaire particulière qui est perturbée. N’oubliez pas que vous travaillez avec des bactéries vivantes.

Bien que Pseudomona Senge ne soit pas pathogène pour l’homme, n’oubliez pas de vous débarrasser correctement des consommables contaminés et des plantes infectées lors de l’exécution de cette procédure.