Un nouveau-né de la moelle épinière de souris Compression Modèle de lésion
27 mars 2016
Cet article décrit une méthode permettant de générer une lésion par compression de la moelle épinière (LME) reproductible chez la souris néonatale. Le modèle fournit une plate-forme avantageuse pour étudier les mécanismes de plasticité adaptative qui sous-tendent la récupération fonctionnelle spontanée.
L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une lésion de compression de la moelle épinière reproductible chez une souris néonatale. Ceci est réalisé en anesthésiant d’abord profondément la souris. Puis effectuer une laminectomie dorsale pour révéler la moelle épinière.
Et enfin en faisant la blessure de compression. Nous avons récemment établi un modèle de souris néonatale pour les lésions de la moelle épinière et nous avons démontré que les souris néonatales présentent un degré étonnant de plasticité adaptative. L’étude de ce mécanisme sous-jacent à la récupération peut fournir des informations importantes, qui pourraient être utilisées dans le traitement des lésions de la moelle épinière.
Dans cette vidéo, nous allons montrer comment effectuer une lésion par compression de la moelle épinière chez une souris âgée d’un jour. Cette intervention chirurgicale comprend l’anesthésie, la laminectomie et deux compressions épidurales à clip. Préparation à l’opération.
L’opération est réalisée sous stéréomicroscope. Placez un coussin chauffant sous le microscope. Il est crucial de garder le chiot au chaud pour éviter une mort subite pendant la chirurgie.
Placez une couverture chirurgicale ou une grande feuille de papier de laboratoire doux et propre sur le coussin chauffant. Pour l’analgésie préchirurgicale, préparez une seringue à insuline de calibre 30 de 0,3 millilitre, remplie de l’anesthésique local, Marcaine, dilué avec du PBS stérile, jusqu’à une concentration finale de 2,5 milligrammes par millilitre. Pour l’incision cutanée, l’ablation musculaire et la laminectomie, utilisez un micro-couteau, des pinces fines et des ciseaux d’iridectomie fins.
Notez qu’ici, on utilise aussi des pinces que l’on a pliées aux pointes pour former des dents. Ceux-ci fonctionnent mieux que les pinces dentées disponibles dans le commerce, car les dents doivent être très petites. Pour la compression de la moelle épinière, utilisez un miniclip d’anévrisme temporaire Yasargil spécialement modifié, que nous décrirons plus tard.
Une petite longueur de tube capillaire en plastique est également nécessaire pour fabriquer un bouchon afin d’empêcher la fermeture complète du clip, et un applicateur de clip pour placer le clip. Pour la suture, utilisez un porte-aiguille et de petits ciseaux pour couper le fil. Pour le traitement de la douleur, diluer Temgesic dans du PBS stérile, à 0,03 milligramme par millilitre.
La lésion de la moelle épinière implique une compression entraînée par un clip, à l’aide d’un miniclip d’anévrisme temporaire Yasargil. Avant utilisation, le clip doit être modifié mécaniquement, en réduisant l’épaisseur des lames à 150 micromètres à l’aide d’une pierre à aiguiser. Juste avant l’opération, coupez un court tronçon de tube en plastique et placez-le sur l’une des lames du clip.
Le tube agit comme un bouchon pour empêcher la fermeture complète du clip. Anesthésie et analgésie. Pour l’anesthésie au gaz, nous utilisons un vaporisateur suprane relié à une bouteille d’oxygène.
L’isoflurane est l’anesthésique qui est vaporisé dans de l’oxygène pur. Pour distribuer l’Isoflurane, mélange d’oxygène à la souris, vous devez construire un masque nasal adapté aux nouveau-nés. Les souris néonatales sont si petites que le masque peut être fabriqué à partir de l’extrémité d’une seringue, qui sert d’entrée pour le tube en plastique relié à la sortie du vaporisateur.
Sur le côté du masque, percez un petit trou pour relier un tube d’évacuation qui se termine soit par une pompe à vide régulée, soit par une unité de collecte, soit simplement par une hotte. Fabriquez une chambre de trop-plein d’anesthésie à l’aide d’une boîte de Pétri en plastique de 150 x 25 millilitres. D’un côté, faites un trou assez grand pour la tête de la souris.
Du côté opposé, faites deux trous plus petits du diamètre du tube en plastique. Enfin, faites un trou d’évacuation, plus petit que les autres, sur le dessus de la parabole. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 250 microlitres et introduisez-la dans ce dernier trou.
La pointe de la pipette fonctionne comme un connecteur pour le tube d’évacuation qui est relié à un dispositif de vide réglé pour une légère pression négative. À l’aide de pâte à modeler, fixez le masque juste à l’intérieur du trou pour la tête de la souris. À l’aide de ruban adhésif ou de pâte à modeler, fixez le tube en plastique au plafond de la chambre, en vous assurant que les tubes sont bien positionnés dans les trous appropriés.
Placez la chambre sur la couverture chirurgicale sous le microscope. L’ensemble du système est représenté dans ce schéma. Un robinet d’arrêt à trois voies est placé sur la sortie du vaporisateur.
Ici, le chemin vers la chambre de sommeil est libre, tandis que le chemin vers le masque est bloqué et la souris peut être placée dans la chambre de sommeil pour initier la sédation. En tournant le robinet d’arrêt à trois voies vers la droite, le gaz s’écoule vers le masque et bloque le chemin vers la chambre de sommeil. Dans cette configuration, la souris peut être transférée sur le masque.
Les fuites de gaz sont éliminées par le vide de la chambre de trop-plein. Sélectionnez un bébé souris qui a récemment bu du lait, comme en témoigne la couleur blanche visible à travers la peau. Placez le chiot dans la chambre de sommeil et introduisez de l’isoflurane vaporisé à 4 % pour obtenir une sédation rapide.
Transférez le chiot dans le masque. Positionnez soigneusement le museau de la souris bien dans le masque pour assurer une exposition suffisante au gaz anesthésique. Tournez le robinet d’arrêt à trois voies, pour dévier le gaz vers le masque.
Injecter par voie sous-cutanée, 50 microlitres de Marcaine à 2,5 milligrammes par millilitre, au site souhaité de la chirurgie. Attention à ne pas injecter trop profondément, car les vaisseaux sanguins peuvent facilement être touchés et l’introduction de la marcaine dans un vaisseau est mortelle. Essuyez l’excédent de marcaine avec une petite compresse stérile.
Laminectomie dorsale. Réduire la concentration d’isoflurane à un à deux pour cent. Après quelques minutes, percez la peau avec un micro-couteau et faites une ouverture de transfert de huit à neuf millimètres en tirant doucement sur la peau dans le sens de la caudale rostrale.
Une ouverture de transfert est beaucoup plus pratique et donne un meilleur accès latéral pour la réalisation de la laminectomie. Rétractez les bords de l’incision cutanée du tissu sous-jacent, en insérant des morceaux de spongistatine, sous-cutanés rostrals et caudales à l’incision. Coupez les muscles prévertébraux avec des ciseaux fins pour exposer la colonne vertébrale.
Notez que chez le nouveau-né, le processus rachidien n’est pas complètement développé. Identifiez la ligne médiane et coupez le limbe transversalement avec les ciseaux fins. Faites attention à ne pas couper trop profondément, car cela peut potentiellement endommager la dure-mère et même la moelle épinière.
Placez soigneusement une lame d’une pince fine entre le limbe et la dure-mère. Saisissez la lame en fermant la pince et soulevez-la avec précaution jusqu’à ce qu’elle se détache, laissant la dure-mère intacte. Répétez l’étape, deux à trois fois pour obtenir une laminectomie à un à deux segments.
Contrôlez les saignements à l’aide de petits morceaux de spongistatine. À l’aide de la pince mince comme rongeurs, retirez des parties des articulations facettaires bilatéralement pour gagner suffisamment d’espace pour placer le miniclip d’anévrisme modifié dans le canal vertébral. Cette étape entraîne souvent des saignements qui peuvent être contrôlés à l’aide de petits morceaux de spongistatine.
Pour améliorer la visibilité, il est parfois avantageux de rincer avec du PBS stérile chaud, 37 degrés centigrades. Génération de la lésion de compression de la moelle épinière. Ouvrez le clip et placez les lames de chaque côté de la moelle épinière dans les espaces entre les articulations facettaires et le cordon.
Assurez-vous que les lames sont insérées suffisamment profondément pour englober la partie ventrale de la moelle épinière. Fermez rapidement le clip, tout en maintenant l’applicateur en place, pour éviter que le clip ne glisse vers l’arrière. Après 15 secondes, relâchez rapidement le clip.
Nettoyez la plaie avec de la spongistatine. Pour obtenir une compression symétrique, inversez les lames et effectuez une deuxième compression pendant 15 secondes dans l’orientation opposée. Suture. Retirez les morceaux de spongistatine qui ont été placés sous la peau au début de la chirurgie et fermez la peau avec des sutures 6.0.
Injectez 0,05 millilitre, Temgesic, à 0,03 milligramme par millilitre. par voie sous-cutanée avec une seringue à insuline de calibre 30 et placez le chiot dans un environnement à température contrôlée à 30 degrés centigrades pendant quelques heures. Pour réduire le comportement maternel agressif envers le chiot opéré pendant la première nuit, après la chirurgie, préparez une solution de diazépam, diluée dans du PBS propre, à 0,1 milligramme par millilitre pour une injection intrapéritonéale à huit grammes par kilogramme. Résultats.
Comme le montre ce graphique, six heures après la compression de la moelle épinière, au niveau thoracique inférieur, les membres postérieurs des souris blessées sont paralysés, alors que les membres antérieurs ne le sont pas. Dans le cas des animaux témoins fictifs, qui n’ont subi qu’une laminectomie, les membres postérieurs et antérieurs sont très mobiles. La section de la moelle épinière montre du sang résiduel à la vue de la blessure.
De plus, le tissu est translucide, ce qui suggère une perte de tissu, ce qui conduit souvent à la formation d’une carie plusieurs jours plus tard. Conclusion. Après cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer une lésion par compression de la moelle épinière chez une souris néonatale. L’avantage d’utiliser des souris néonatales est que nous pouvons utiliser des méthodes spécifiques pour traiter la plasticité adaptative, qui ne peut pas être utilisée chez les souris adultes.
De plus, le modèle fournit une plate-forme pour tester des approches thérapeutiques, telles que la greffe de cellules souches.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant de provoquer une lésion de compression de la moelle épinière (SCI) reproductible chez des souriceaux néonatals. Ce modèle présente un avantage pour l'étude des mécanismes de plasticité adaptative sous-jacents à la récupération fonctionnelle spontanée.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Neurobiologie
- Modèles de lésions
Contexte
- Les lésions de la moelle épinière peuvent entraîner des troubles fonctionnels importants.
- Les souris néonatales présentent une capacité remarquable de récupération.
- La compréhension de la plasticité adaptative est essentielle pour le développement de traitements.
- Ce modèle permet une expérimentation contrôlée sur les lésions de la moelle épinière.
Objectif de l'étude
- Établir un modèle reproductible de lésion par compression de la moelle épinière.
- Étudier les mécanismes de récupération chez les souriceaux néonatals.
- Fournir des éléments de compréhension pour des approches thérapeutiques potentielles.
Méthodes utilisées
- Anesthésie profonde de souriceaux.
- Laminectomie dorsale pour exposer la moelle épinière.
- Lésion par compression à l’aide d’un miniclamp modifié pour anévrisme temporaire Yasargil.
- Analgésie postopératoire pour la gestion de la douleur.
Résultats principaux
- Le modèle induit avec succès une lésion par compression de la moelle épinière.
- Les souriceaux néonatals montrent une plasticité adaptative importante après la lésion.
- Les connaissances acquises pourraient guider les traitements futurs des lésions médullaires.
- Un protocole chirurgical détaillé assure la reproductibilité du modèle.
Conclusions
- Ce modèle constitue un outil précieux pour l'étude des lésions de la moelle épinière.
- La compréhension des mécanismes de récupération peut conduire à de meilleures thérapies.
- Les recherches futures pourront s'appuyer sur ces travaux fondamentaux.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce modèle de compression de la moelle épinière chez la souris néonatale permet d'étudier mécanistiquement la plasticité adaptative dans la récupération après une lésion survenue en début de vie, offrant un système pertinent sur le plan pathologique pour évaluer le risque des hypothèses thérapeutiques. En reconstituant la dynamique spontanée de récupération fonctionnelle, ce modèle soutient la validation de cibles thérapeutiques et le criblage phénotypique dans les programmes de neurosciences précliniques. Sa pertinence par rapport aux lésions médullaires pédiatriques et sa possible continuité translationnelle aux indications adultes renforcent la prise de décision à l'échelle du portefeuille dans la découverte de neurothérapeutiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques liées aux mécanismes de plasticité adaptative dans la lésion médullaire.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système biologiquement pertinent pour la validation fonctionnelle de cibles thérapeutiques à l'aide de paramètres comportementaux et d'enregistrements électrophysiologiques.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques en reliant les voies de plasticité précoces à des cibles thérapeutiques potentielles.
Élaboration de tests et criblage
- Prêt-à-l'emploi pour les tests : Génère un modèle de lésion standardisé et reproductible, adapté au criblage de composés et aux essais d'interventions thérapeutiques.
- Paramètres quantitatifs : Permet des mesures de variables dépendantes incluant la motricité des membres postérieurs, la connectivité synaptique et l'activité électrophysiologique.
- Évolutivité : Permet l'enregistrement optique à haut débit et l'analyse physiologique ex vivo pour le développement d'essais ultérieurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise une lésion médullaire pédiatrique avec des signes d'atteinte aiguë des membres postérieurs et une récupération fonctionnelle dans les deux semaines.
- Continuité translationnelle : Exploite les mécanismes de plasticité partagés entre la moelle épinière néonatale et adulte pour générer des connaissances transversales selon l'âge.
- Progrès ajusté au risque : Permet l'évaluation de candidats thérapeutiques en utilisant la récupération fonctionnelle et la reconnexion synaptique comme biomarqueurs prédictifs.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le modèle s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cibles jusqu'aux tests d'efficacité préclinique, en particulier pour les approches neuroprotectrices et neurorestauratrices.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur la plasticité adaptative et les mécanismes de récupération fonctionnelle après une compression de la moelle épinière.
- Essais : Permet le développement de tests pour l'évaluation de composés à l'aide de paramètres comportementaux et physiologiques quantifiables.
- Analytique : Génère des mesures de variables dépendantes telles que la signalisation électrophysiologique et l'enregistrement optique de la connectivité synaptique.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes concernant la plasticité précoce à la lésion médullaire chez l'adulte par le biais de mécanismes biologiques conservés.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme réutilisable pour des tests itératifs d'interventions thérapeutiques au cours des phases de découverte et préclinique.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la cible en élucidant les mécanismes de la récupération spontanée et de la plasticité adaptative.
- Valeur opérationnelle : Fournit un modèle chirurgical reproductible avec des paramètres de compression standardisés et des soins postopératoires normalisés.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en fournissant des signaux précoces d'efficacité dans un modèle de lésion à forte plasticité.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des neurothérapeutiques fondée sur des biomarqueurs de la récupération fonctionnelle et de la réparation synaptique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation de souriceaux néonatals, en microchirurgie et en techniques d’enregistrement électrophysiologique.
- Dépend d’un équipement spécialisé comprenant un microscope stéréo, un applicateur de mini-pince pour anévrisme et des systèmes de récupération à température contrôlée.
- Exige une standardisation entre les équipes chirurgicales pour réaliser de manière reproductible la laminectomie et l’application de la lésion par compression.
- Implique des considérations d’adaptation lors de la transposition des résultats obtenus chez le néonatal vers des contextes de moelle épinière adulte ou humaine.
- Les limites pratiques incluent la spécificité du modèle aux stades postnataux précoces ainsi que la variabilité potentielle de la gravité de la lésion en fonction du positionnement de la pince.
