L'isolement, la caractérisation et de l'examen fonctionnel du Réseau de cellules gingivale immunitaire
16 février 2016
Nous avons établi une technique pour l'isolement, la caractérisation phénotypique et l'analyse fonctionnelle des cellules immunitaires de gencive murin.
L’objectif global de cette méthode est d’isoler les cellules immunitaires gingivales pour la caractérisation approfondie des réponses immunitaires liées à l’immunité buccale et à la parodontite. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunité orale, telles que les facteurs cellulaires impliqués dans la pathogenèse de la parodontite. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle permet d’évaluer le réseau de cellules immunitaires orales et d’isoler suffisamment de cellules viables pour des investigations in vitro en aval.
Comme première étape de ce protocole, commencez par placer des broches pour immobiliser le corps de la souris et ouvrir les cavités thoracique et abdominale pour exposer le cœur et les organes internes. Ensuite, faites une incision dans la veine cave et utilisez une seringue de 3 millilitres, équipée d’une aiguille de calibre 27, pour profuser 3 millilitres de PBS via le ventricule gauche. Lorsque tout le sang a été rincé, épinglez la tête de la souris sur un tampon de dissection, avec l’estomac vers le haut.
Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper chaque commissure de la lèvre vers le cou, en séparant la peau qui recouvre la région de la mandibule et du cou, et en exposant les tissus et les muscles sous-jacents. Coupez entre les incisives inférieures pour séparer les deux côtés de la mandibule. Immobilisez chaque côté de la mandibule séparée à l’aide d’aiguilles de calibre 25 pour accéder à la cavité buccale.
Après avoir identifié le palais, utilisez une lame chirurgicale numéro 10 pour faire des incisions verticales juste en avant de la première molaire et en arrière de la troisième molaire. Ensuite, disséquez le tissu loin de la cavité nasale, et disséquez également les blocs de la mandibule. Ensuite, éliminez l’excès de tissu du bord de la gencive et transférez les blocs maxillaire et mandibulaire dans un tube conique de 50 millilitres contenant 5 millilitres de collagénase et de DNase sur de la glace.
Digérez le tissu dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure, en ajoutant 50 microlitres d’EDTA à 0,5 molaire au cours des cinq dernières minutes. Ajoutez ensuite 5 millilitres de milieu DNase froid aux mouchoirs et mélangez doucement le contenu du tube en remuant. Ensuite, transférez les quatre blocs de tissu dans une boîte de Pétri.
Et couvrez-les de 500 microlitres de milieu DNase frais. Utilisez un scalpel pour retirer la gencive de chaque bloc de tissu. Et transférez tout le contenu du plat dans une passoire à cellules de 70 microns sur un tube de 50 millilitres.
Lavez la boîte de Pétri et la passoire avec 3 à 5 millilitres de milieu frais DNase. Ensuite, utilisez le piston d’une seringue stérile de 3 millilitres pour écraser le tissu gingival contre le grillage de la passoire. Rincer la passoire avec 30 à 35 millilitres de milieu DNase froid, et centrifuger le filtrat.
Ensuite, mettez le palais en suspension dans 1 millilitre de milieu complet et déterminez le nombre de cellules viables. L’isolement et le traitement des cellules immunitaires, tels qu’ils viennent d’être démontrés, produisent un nombre suffisant de cellules pour effectuer une stimulation et une caractérisation ex-vivo des modèles de sécrétion de cytokines des cellules gingivales chez les animaux de type sauvage et les animaux sensibles à la parodontite. En effet, la composition des cellules immunitaires gingivales murines peut être analysée, comme le démontrent ces graphiques de densité évaluant les compartiments des cellules T et des cellules tueuses naturelles chez les souris knock-out LFA sensibles à la parodontite.
À l’aide des stratégies de contrôle appropriées, la production intracellulaire de cytokines des lymphocytes TCR bêta CD4 positifs, TCR bêta CD8 positifs et TCR gamma delta positifs, ainsi que des cellules NK et lymphoïdes innées, peut également être déterminée. Une fois maîtrisées, les cellules peuvent être isolées en trois heures pour l’immunomarquage si la technique est correctement réalisée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de terminer toutes les étapes efficacement et rapidement, en gardant les cellules sur la glace chaque fois qu’elles ne sont pas manipulées.
En suivant cette procédure, d’autres méthodes, comme le tri des cellules, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires liées à la fonction des sous-ensembles de cellules spécifiques.
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Aperçu
Cet article présente une technique permettant d'isoler et de caractériser les cellules immunitaires provenant de la gencive murine. La méthode vise à améliorer la compréhension de l'immunité orale et de la parodontite.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Biologie orale
- Parodontologie
Contexte
- Comprendre les réponses immunitaires dans la cavité orale est essentiel pour aborder les maladies parodontales.
- Les cellules immunitaires gingivales jouent un rôle important dans l'immunité orale.
- Les méthodes actuelles peuvent ne pas fournir suffisamment de cellules viables pour une analyse détaillée.
- Cette technique vise à combler cette lacune en permettant des études fonctionnelles approfondies.
Objectif de l'étude
- Isoler les cellules immunitaires gingivales afin de les caractériser.
- Étudier les facteurs cellulaires impliqués dans la pathogenèse de la parodontite.
- Évaluer le réseau des cellules immunitaires buccales.
Méthodes utilisées
- Immobilisation de la souris et exposition des organes internes.
- Incision de la veine cave pour le rinçage sanguin.
- Utilisation d'une seringue pour perfuser du PBS par le ventricule gauche.
- Préparation de la souris pour des analyses supplémentaires.
Résultats principaux
- Isolation réussie de cellules immunitaires gingivales viables.
- Caractérisation des réponses immunitaires liées à la santé bucco-dentaire.
- Éléments de compréhension de la pathogenèse de la parodontite.
- Potentiel pour des investigations ultérieures in vitro.
Conclusions
- Cette technique fournit un outil précieux pour l'étude de l'immunité orale.
- Elle améliore la compréhension de la dynamique des cellules immunitaires dans les tissus gingivaux.
- Des études futures pourront exploiter cette méthode afin d'obtenir des connaissances plus approfondies sur les maladies parodontales.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
L'isolement précis et le profilage fonctionnel des cellules immunitaires gingivales permettent une détection mécanistique des risques en immunologie buccale et soutiennent la validation de cibles dans la recherche sur les maladies inflammatoires. Ce protocole fournit des populations cellulaires à haute viabilité pour un phénotypage quantitatif et des tests fonctionnels ex vivo, renforçant ainsi la fiabilité prédictive des études exploratoires et translationnelles. Cette approche est conçue pour éclairer les décisions stratégiques en recherche et développement en immunologie et en santé bucco-dentaire, en permettant une analyse rigoureuse des réseaux immunitaires résidents dans les tissus.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'analyse des sous-populations de cellules immunitaires impliquées dans la pathogenèse inflammatoire buccale.
- Permet la validation fonctionnelle de cibles grâce à des tests de sécrétion de cytokines ex vivo.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en clarifiant la contribution des cellules immunitaires aux modèles de maladie.
- Fournit des données quantitatives pour le tri des projets fondé sur des hypothèses.
Tests et développement de dosages
- Fournit des cellules immunitaires viables et caractérisées sur le plan phénotypique pour le développement d'analyses en aval.
- Permet une préparation reproductible d'échantillons biologiques pour des protocoles de criblage standardisés.
- Permet des mesures quantitatives de la fonction immunitaire pour l'évaluation de composés.
- Améliore l'évolutivité et la prêts-à-l'emploi des analyses pour les plateformes de criblage à contenu élevé.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne le profilage des cellules immunitaires avec des modèles buccaux pertinents pour la maladie afin d'assurer une continuité translationnelle.
- Permet la découverte de biomarqueurs fonctionnels dans les études précliniques d'immunopathologie buccale.
- Facilite l'avancement ajusté au risque de stratégies immunomodulatrices ciblant les tissus buccaux.
- Offre des éclairages mécanistiques pour guider la sélection préclinique de candidats.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'intègre dans la continuité découverte-préclinique en fournissant des préparations de cellules immunitaires de haute qualité pour des études mécanistiques ainsi que pour des criblages fonctionnels dans des modèles de maladies orales.
- Biologie de la découverte : Fait progresser la vérification d'hypothèses sur les rôles des cellules immunitaires dans l'homéostasie et la pathologie des tissus buccaux.
- Écrans de sélection : Fournit des populations cellulaires reproductibles et viables pour le développement de tests et l'évaluation de composés.
- Analytique : Permet la mesure quantitative de la sécrétion de cytokines et des phénotypes des cellules immunitaires pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes à la validation préclinique dans des modèles buccaux pertinents pour la maladie.
- Réutilisation en milieu professionnel : Établit un flux de travail standardisé adaptable à divers programmes de recherche en immunologie buccale.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la recherche sur l'immunité orale.
- Valeur opérationnelle : Permet une isolation standardisée, reproductible et échelonnée des cellules immunitaires, assurant la comparabilité entre études.
- Valeur stratégique : Soutient des décisions éclairées de type aller/arrêter et un développement capital-efficient des actifs en immunologie orale.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles et des approches dans les programmes d'immunologie orale et muqueuse.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissection murine et en manipulation des cellules immunitaires.
- Exige un accès à la cytométrie en flux et aux infrastructures pour les tests fonctionnels ex vivo.
- Implique une standardisation entre équipes pour une isolation et une analyse cellulaire reproductibles.
- L'adaptation à d'autres tissus muqueux peut nécessiter une optimisation du protocole.
- La viabilité et le rendement cellulaires sont sensibles au chronométrage des procédures et au contrôle de la température.
