Immobilisation de Multi-biocatalyseurs dans des billes d'alginate pour cofacteur Régénération et amélioration de réutilisabilité

L’objectif global de cette procédure expérimentale est de démontrer l’utilisation d’un système biocatalytique couplé à cellules entières immobilisé dans des billes d’alginate pour améliorer le rendement de production et la réutilisabilité. C’est mon sujet, j’ai répondu à des questions clés dans le domaine de la biocatalyse telles que l’immobilisation des biocatalyseurs, la stabilité, la régénération des cofacteurs, et les biocatalyseurs à cellules entières. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre une approche simple mais flexible pour améliorer la production de nombreuses biomolécules importantes par des voies dépendantes des cofacteurs.

Deux souches recombinantes d’E. coli sont utilisées dans ce protocole. SpNOx E coli, qui exprime la NADH oxydase, et HjLAD E coli, qui exprime la L-arabinitol déshydrogénase. Étant donné que cette procédure est la même pour les deux souches d’E. coli, elle ne sera démontrée que pour HjLAD E. coli.

Inoculez une seule colonie de HjLAD E coli dans trois millilitres de milieu LB, complété par 15 microgrammes par millilitre de Ket-A-My-Sin, et incubez pendant la nuit dans un agitateur incubateur. Le lendemain, diluez la culture d’un à 100 dans 200 millilitres de LB frais contenant 15 microgrammes par millilitre de Ket-A-My-Sin, et incubez à 37 degrés Celsius à 250 tr/min jusqu’à ce que la DO 600 atteigne environ 0,6. Induire l’expression de la protéine HjLAD en ajoutant 0,1 millimolaire d’IPTG au milieu de culture et en incubant à 25 degrés Celsius, 200 tr/min, pendant six heures.

Récoltez les cellules induites par centrifugation à 3200 fois G et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Jetez le surnageant et procédez au traitement de la pastille cellulaire comme illustré dans le segment suivant. Pour commencer cette procédure, nous suspendons les pastilles cellulaires de HjLAD E coli et de SpNox E coli séparément dans 50 millimolaires de tampon Tris-Hcl, à une densité cellulaire de cinq grammes de poids de cellules sèches par litre.

Dans un tube à fond rond de 14 millilitres, mélangez 600 microlitres de cinq grammes de poids de cellules sèches par litre de HjLAD E coli, 600 microlitres de cinq grammes de poids de cellules sèches par litre de SpNOx E coli, 100 microlitres de 20 millimolaires de NAD plus et 150 microlitres de L-aribinitol à deux molaires. Amenez le volume de réaction à deux millilitres en ajoutant 550 microlitres de Tris-HCl de 50 millimolaires. Incuber le mélange réactionnel à 30 degrés Celsius et 200 tr/min pendant huit heures.

Après huit heures, centrifugez le mélange à 3200 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, et récupérez le surnageant de réaction. Pour quantifier la production de L-xylulose par un dosage colorimétrique, aspirez 100 microlitres du surnageant collecté dans un tube de 1,5 millimètre. Ajoutez 50 microlitres de cystéine à 1,5 %, 900 litres d’acide sulfurique à 70 % et 50 microlitres de Kar-Piz-All à 0,1 % dissous dans de l’éthanol, et mélangez doucement en inversant le tube trois fois.

Incuber le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant 20 minutes. Mesurez l’absorbance optique du mélange réactionnel à 560 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. Commencer le protocole d’immobilisation en préparant une solution d’alginate à 4 %.

Ajoutez 0,8 gramme d’alginate de sodium à 20 millilitres d’eau distillée et chauffez le mélange pour dissoudre l’alginate de sodium. Ajoutez 600 microlitres de cinq grammes de poids de cellules sèches par litre de HjLAD E coli et 600 microlitres de cinq grammes de poids de cellules sèches par litre de SpNOx E coli à 1,2 millilitres de la solution d’alginate à 4 %. Mélangez les cellules et l’alginate par pipetage doux pour éviter la formation de bulles.

Pour assurer la formation de billes d’alginate de taille, de morphologie et de rigidité uniformes, il est essentiel d’ajouter la suspension d’alginate cellulaire pour une distance optimale de manière lente et goutte à goutte, dans un volume suffisant de solution de chlorure de calcium pour couvrir toutes les billes. Aspirez la suspension cellulaire d’alginate dans une seringue à l’aide d’une aiguille, puis ajoutez le mélange goutte à goutte dans une solution de chlorure de calcium de 0,3 molaire dans un bécher de 100 millilitres avec agitation continue. Laissez les billes dans la solution de chlorure de calcium pendant deux à trois heures à température ambiante sans remuer pour permettre la réticulation.

Décantez la solution de chlorure de calcium sans déranger les billes en versant soigneusement la solution de chlorure de calcium dans un tube conique de 15 millilitres. Transférez les perles restantes dans un autre tube conique de 50 millilitres. Pour éliminer l’excès de chlorure de calcium et les cellules non encapsulées, lavez les billes avec un tampon Tris-HCl de 50 millimolaires.

Ajoutez 10 millilitres de tampon aux billes et laissez la suspension reposer sans être dérangée pendant trois à cinq minutes. Une fois que les billes se déposent au fond, décantez le tampon dans un autre récipient. De cette manière, lavez les perles trois fois.

Ne centrifugez pas les billes à une étape donnée ou elles se rompront. Ne jetez pas le tampon de lavage Tris-HCl utilisé. Tirez les 30 millilitres de tampon de lavage usagé avec la solution de chlorure de calcium utilisée recueillie précédemment.

Granulez les cellules E coli non immobilisées par centrifugation de la solution de chlorure de calcium et de Tris-HCl à 3200 fois G pendant 20 minutes. Transférez les billes lavées dans un tube. Par la suite, évaluer la biosynthèse du L-xylulose en suivant la procédure démontrée pour les pastilles cellulaires, mais en utilisant toutes les billes lavées à la place des pastilles cellulaires.

Pour évaluer la stabilité des biocatalyseurs immobilisés pour la production de L-xylulose, prélevez les billes après leur formation. Et laver deux fois avec 10 millilitres de tampon Tris-HCl de 50 millimolaires sans centrifugation comme indiqué précédemment. Utilisez toutes les billes lavées pour effectuer la réaction de production de L-xylulose comme démontré précédemment.

Quantifier la production de L-xylulose par un dosage colorimétrique, comme démontré précédemment. Répétez la réaction de production de L-xylulose pendant le nombre souhaité de cycles de production et mesurez la quantité de L-xylulose produite dans le surnageant de réaction à chaque cycle. La production de L-xylulose est renforcée par ce système biocatalytique couplé à cellules entières.

À partir d’une concentration initiale de 150 millimolaires de L-aribinitol, l’utilisation du biocatalyseur HjLAD E coli seul a produit un rendement de 79 % de L-xylulose. En comparaison, l’utilisation des cellules HjLAD E coli et SpNOx E coli dans un rapport de un pour un a produit un rendement de 96 % de L-xylulose. Une évaluation des paramètres influençant l’efficacité d’immobilisation du biocatalyseur a révélé que l’efficacité augmente avec l’augmentation de la concentration d’alginate de sodium de l’ordre de un à trois pour cent.

Cependant, des concentrations d’alginate de sodium supérieures à 2 % entraînent une diminution du rendement en L-xylulose. En utilisant une concentration d’alginate de sodium de 2 %, la concentration optimale de chlorure de calcium pour l’immobilisation et le rendement en L-xylulose a été déterminée à 0,3 molaire. La réutilisation du biocatalyseur a été évaluée.

Dans ce graphique, la production de L-xylulose pour sept cycles successifs de réutilisation de biocatalyseurs de cellules entières immobilisés et couplés libres est représentée respectivement en gris foncé et gris clair. Bien que le rendement maximal en L-xylulose par les biocatalyseurs de cellules entières couplés immobilisés soit inférieur à celui d’un système de cellules entières couplées libres, la réutilisabilité est améliorée par l’immobilisation. Au terme de sept cycles de réutilisation successifs, les biocatalyseurs immobilisés ont conservé leur stabilité et conservé 65 % du rendement initial en L-xylulose.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biocatalyse pour explorer les rendements de biocatalyseurs multicellulaires complets et les principales réactions qui impliquent des cofacteurs.