Prédiction et validation des éléments de réglementation gène activé Pendant l'acide rétinoïque induit la différenciation des cellules souches embryonnaires

L’objectif général de cette vidéo est de fournir un ensemble intégré de méthodes pour identifier et valider expérimentalement les éléments régulateurs généomiques appelés amplificateurs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la transcription et la régulation d’événements biologiques, y compris la sélection et l’utilisation d’amplificateurs, en utilisant la différenciation cellulaire ou en réponse à des stimuli externes. Le principal avantage du flux de travail présenté est qu’un protocole peut être facilement adapté et utilisé dans n’importe quel système de modèle cellulaire.

Je vais vous montrer les étapes de la procédure. Pour commencer, choisissez un amplificateur candidat en fonction de l’analyse de séquençage de puce préexistante. Utilisez un navigateur génomique pour afficher les résultats de l’expérience de séquençage de puce souhaitée et identifier les sites de liaison à proximité du gène d’intérêt.

Choisissez Définir une région d’intérêt pour obtenir une séquence de paires de 200 à 400 bases de la région génomique sélectionnée et utilisez les séquences pour la conception ultérieure de l’amorce. À l’aide de techniques de biologie moléculaire standard, amplifiez et clonez la région génomique sélectionnée dans une construction plasmidique rapporteure. Pour tester l’activité de l’amplificateur, transfectez les constructions rapporteures dans des cellules souches embryonnaires de masse en ajoutant d’abord 200 microlitres de solution de gélatine à 0,1 % par puits dans des plaques de 48 puits.

Incuber les plaques pendant 30 minutes avant de plaquer. La veille de la transfection, la souche embryonnaire sans plaque, ou cellules ES, dans 250 microlitres de milieu ES à une densité de trois fois 10 à la quatrième cellule par puits. Le jour de la transfection, préparez les mélanges de plasmides, en faisant assez pour huit puits de chaque mélange.

Ajoutez un milieu sérique réduit de qualité de transfection à chaque mélange de plasmides pour porter le volume à 106 microlitres. Ensuite, ajoutez 4,5 microlitres de réactif de transfection de qualité ES et mélangez soigneusement en pipetant 15 fois de haut en bas. Incuber le mélange de transfection pendant 15 minutes à température ambiante.

Après l’incubation, ajoutez 13 microlitres par puits du mélange de transfection aux cellules et mélangez soigneusement par pipetage. Ensuite, remettez les cellules dans l’incubateur pendant la nuit avant le traitement du lichen. L’efficacité de la transfection est une étape critique.

Si un autre type de cellule est utilisé, cette étape nécessite une optimisation. Utilisez le type de cellule le plus pertinent pour tester l’activité de l’amplificateur afin de minimiser les effets dépendants du contexte. Le lendemain, retirez soigneusement le milieu par aspiration et ajoutez 250 microlitres de milieu frais par puits contenant une micromolaire d’acide trans rétinoïque, ou DMSO comme véhicule.

Incuber les cellules pendant 24 à 48 heures. Après avoir préparé le tampon de lyse selon le protocole de texte, aspirez soigneusement le milieu des cellules. Utilisez 1X PBS pour faire monter les cellules une fois, puis ajoutez 200 microlitres de tampon de lyse 1X par puits.

Agitez les cellules à température ambiante pendant deux heures. Ensuite, pour une lyse cellulaire complète, congelez les lysats cellulaires dans la plaque à 80 degrés Celsius. Après avoir complètement décongelé les lysats, utilisez une pipette électronique multicanaux pour transférer 80 microlitres de lysat cellulaire sur une plaque transparente à 96 puits pour la bêta-galactosidase, et 40 microlitres de lysat sur une plaque blanche pour la mesure de la luciférase.

Pour effectuer la bêta-galactosidase, mélangez un millilitre de tampon de substrat bêta-gal avec quatre milligrammes d’OMPG. Ensuite, ajoutez 3,5 microlitres de bêta-mercaptoéthanol au mélange et ajoutez immédiatement 100 microlitres de tampon aux 80 microlitres de lysat cellulaire. Incuber les réactions à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la légère couleur jaune se développe.

Lire l’absorbance à 420 nanomètres sur un lecteur de plaques et exporter les données. Pour effectuer le test de luciférase, après avoir préparé le réactif de substrat conformément au protocole de texte, réchauffez le réactif de substrat de luciférase à température ambiante avant de commencer. Ensuite, pipetez 100 microlitres dans chaque puits de la plaque blanche contenant les 40 microlitres de lysat cellulaire.

Utilisez immédiatement une machine à compteur luminescent pour mesurer le signal. Obtenez les activités d’au moins trois transfections et expériences indépendantes. Effectuez des calculs pour les deux tests conformément au protocole texte.

Pour concevoir les amorces pour la détection de l’ARNe par RTCPR, sélectionnez une région génomique qui se trouve à au moins 1,5 à deux kilo-bases de tout transcrit de gène annoté. Identifiez la direction relative du gène et déterminez la position des transcrits sens et antisens. Pour concevoir des amorces pour la quantification de l’ARN amplificateur, choisissez des régions situées à 200-1 000 paires de bases du centre du site de liaison du facteur de transcription.

Si le gène est situé sur le brin négatif, copiez 200 à 300 paires de bases du brin positif et convertissez la séquence pour obtenir la séquence inverse du complément. Ensuite, utilisez cette séquence pour la conception ultérieure de l’amorce. Réglez la plage de taille du produit entre 80 et 150 paires de bases.

Pour mesurer la transcription de l’ARNe, après avoir isolé l’ARN total des cellules traitées conformément au protocole de texte, détecter l’ARNe transcrit inversement par RTCPR à l’aide d’une procédure standard. Mesurer un ARNm non dépendant du traitement pour la normalisation. Comme le montre ici, l’analyse bio-informatique des données de séquençage de la puce RXR obtenues à partir de cellules ES traitées à l’acide rétinoïque a révélé l’enrichissement du demi-site du récepteur nucléaire sous les sites occupés par RXR.

À l’aide d’un algorithme bioinformatique, les résultats de la recherche de motifs pour le demi-site ont été cartographiés sur les données de séquençage de la puce RXR. Cette analyse a identifié des pics de puces chevauchant les sites de liaison des récepteurs nucléaires canoniques. La visualisation des sites en IGV a indiqué un enrichissement des facteurs de transcription proches de Hoxa1.

Une cible RAR RXR précédemment caractérisée. Un activateur punitif pour une nouvelle chaîne cible de PR, PRMT8, a également été identifié. Les régions d’amplification identifiées ont été clonées dans le vecteur rapporteur de la luciférase TK, et les cellules ES ont été transfectées avec ces constructions.

L’activité de la luciférase a été mesurée en l’absence et la présence de PR. Les constructions contenant l’élément de réponse RA, ou RARE, ont montré une augmentation de l’intensité du signal de la luciférase lors du traitement par RA, tandis que la construction sans RARE n’a pas été induite. Pour déterminer si l’expression de l’ARNe sens et anti-sens de l’amplificateur lié à Hoxa1 RAR RXR est corrélée avec l’expression de l’ARNm du gène, le niveau d’ARNe Hoxa1 a également été mesuré. Les résultats ont confirmé que l’activité de l’amplificateur est induite par le traitement à court terme de la PR.

Une fois maîtrisée, cette charge de travail peut être effectuée en quelques jours en effectuant l’expérience de piège d’amplificateur décrite et la quantification de l’amplificateur, on peut fournir des preuves fonctionnelles solides de l’activité de l’amplificateur. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier et de caractériser les amplificateurs punitifs. Une fois qu’un amplificateur est identifié et validé, d’autres méthodes, telles que la capture de confirmation chromosomique, ou CCC, peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions importantes, comme quel gène est régulé par l’amplificateur validé ?