Cutaneous dénervation chirurgicale: une méthode pour tester l'exigence de nerfs dans les modèles murins de la maladie de la peau

L'objectif général de cette procédure est d'examiner l'influence des nerfs sur la peau normale et pathologique. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions essentielles en biologie de la peau normale, comme de savoir si les nerfs cutanés affectent l'homéostasie et les maladies. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de comparer des échantillons de peau intacts et désinnervés provenant du même animal.

La démonstration visuelle de cette technique est essentielle, car les nerfs peuvent être difficiles à identifier et à retirer sans endommager minimalement les tissus environnants. Tout d'abord, anesthésiez la souris et vérifiez qu'elle a atteint le niveau approprié de sédation à l'aide d'une pincée sur l'orteil. Confirmez également que la souris présente une respiration et un rythme cardiaque normaux.

Placez maintenant l'animal sur un tapis chauffant dans une zone chirurgicale stérile. À l’aide d’un tondeur électrique, rasez soigneusement la zone dorsale d’où sera prélevée la biopsie. Ensuite, nettoyez la zone rasée à l’aide de compresses imbibées de Bétadine et d’alcool.

Veillez à retirer toutes les coupures de cheveux du site. Délimitez maintenant le site de biopsie à l’aide d’un marqueur noir. Pour obtenir des sections longitudinales des follicules pileux, le bord le plus long de la biopsie doit être orienté dans le sens antérieur à postérieur, parallèlement à la ligne médiane dorsale.

À l’aide d’un scalpel, réalisez une exérèse en pleine épaisseur sans endommager le fascia musculaire sous-jacent. Les saignements sont généralement minimes. L’échantillon de biopsie doit inclure l’épiderme, le derme, la graisse sous-cutanée et le pannicule carnosus.

Aplatir l'échantillon de peau excisé sur une serviette en papier sèche, côté derme vers le bas. Retirer l'excès de serviette en papier et conserver l'échantillon dans du TBS froid pendant une heure au maximum, si d'autres prélèvements doivent être effectués. Revenir à la souris et suturer le site de biopsie à l'aide de 60 points de suture en nylon espacés d'environ trois millimètres.

Ensuite, surveiller la souris dans une cage de récupération jusqu'à ce qu'elle reprenne connaissance. Utiliser des analgésiques conformément aux directives établies par les services institutionnels de soins aux animaux, et suivre leurs recommandations si la souris semble en détresse. Retirer les points de suture entre sept et dix jours après la chirurgie.

Procédez au traitement des biopsies pour l'histologie ou la coloration en montage entier. Anesthésiez l'animal, rasez entièrement la peau dorsale et nettoyez la zone de manière similaire à la procédure de biopsie. Effectuez ensuite une incision à l’aide d’un scalpel stérile le long de la ligne médiane dorsale, depuis la base du cou jusqu’à environ un demi-centimètre au-dessus de la queue.

À l’aide de pinces stériles à extrémité plate, écarter doucement la peau du côté gauche loin du flanc afin de visualiser le tissu sous-jacent, depuis les bourrelets graisseux scapulaires près du cou jusqu’au-dessus de la patte postérieure. Identifier maintenant le nerf cutané dorsal sous un microscope stéréoscopique. Ceux-ci apparaissent comme des cordons blancs qui descendent caudalement à travers la fascia translucide de la paroi du tronc, avant de faire des coudes marqués et de pénétrer dans le tissu conjonctif lâche situé sous la peau.

Ensuite, à l’aide de pinces ultrafines, retirez le nerf exclusivement du côté gauche de l’animal situé aux niveaux anatomiques T3 à T12, en les arrachant depuis l’endroit où leurs segments s’incurvent au niveau de la paroi du tronc jusqu’à leurs points d’entrée dans la peau. Orientez les pinces verticalement et saisissez les nerfs à environ un demi-centimètre sous leurs points de courbure. Une fois saisis, tirez vers le haut afin d’étirer les nerfs et de les séparer des tissus environnants pour les retirer.

Évitez d'endommager les vaisseaux sanguins adjacents. Veillez à maintenir le tissu humide tout au long de la procédure en appliquant périodiquement des gouttes de solution saline à 0,9 %. Continuez à retirer tous les nerfs s'étendant de la paroi du tronc jusqu'à la peau, mais n'altérez pas les nerfs situés dans la fascia dense de la paroi du tronc.

Ensuite, retirez tous les nerfs présents sur le lambeau de peau exposé. Ces fibres constituent les branches distales du nerf cutané dorsal et apparaissent sous forme de filaments blancs ramifiés, localisés de manière sporadique dans le tissu conjonctif du côté dermique du lambeau de peau. Pour éliminer ces fines branches, positionnez la pince à épiler approximativement parallèlement à la surface dermique, saisissez le nerf et tirez vers le haut.

Retirez tous les nerfs visibles de cette manière. Ne percez pas les vaisseaux sanguins ni la peau. Pendant cette étape, il est important d'éviter de rompre les vaisseaux sanguins adjacents.

Si vous trouvez un nerf accompagné d'un vaisseau sanguin adjacent, suivez-le jusqu'à une zone où aucun vaisseau adjacent n'est présent, puis retirez-le par pincement. Détachez maintenant la peau du côté droit de l'incision médiane dorsale, sans retirer aucun nerf. Cette région servira de contrôle opératoire sham controlatéral.

Enfin, suturer l'animal et assurer le suivi postopératoire comme précédemment. Par la suite, pour confirmer la perte stable des nerfs, plusieurs semaines après l'intervention chirurgicale, piquer délicatement la zone dénervée à l'aide d'une aiguille hypodermique stérile. Noter si l'animal réagit, généralement par un frisson ou un mouvement de la tête.

Si la zone cutanée a été dénervée de manière stable, l'animal présentera peu ou pas de réponse. Prélevez des biopsies cutanées à partir de la zone sans réponse et du côté contrôle homologue pour obtenir des échantillons appariés expérimentaux et témoins. À partir des biopsies, il est important d'analyser plusieurs sections histologiques afin d'identifier d'éventuelles différences dans l'abondance ou la morphologie des dômes tactiles entre les spécimens témoins et dénervés.

La souche de souris glebe one cree ERT2 permet de cibler la recombinaison génétique induite par le tamoxifène vers des zones de la peau présentant une activité élevée de la voie hedgehog, comme les épithéliums des dômes tactiles. Ces souris ont été croisées avec des souris rapporteuses induisant abolaxi afin de visualiser les épithéliums des dômes tactiles. Les nœuds sont essentiels pour maintenir à la fois les dômes tactiles normaux et leurs cellules de Merkel associées.

Ce phénomène est démontré expérimentalement par la perte progressive de la morphologie normale du dôme tactile, ainsi que par la disparition des cellules exprimant la kératine huit après la dénervation. Les nerfs jouent également un rôle essentiel dans la promotion de la signalisation hedgehog dans le dôme tactile, comme observé par l'expression de Glebe one cree ERE2 et par la coloration immunohistochimique du facteur bêta du complexe d'adhésion des cellules épidermiques, réalisée sur des échantillons de peau provenant à la fois de groupes témoins et de groupes dénervés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser chirurgicalement l'ablation des nerfs cutanés dorsaux afin de déterminer si ces nerfs participent au fonctionnement normal de la peau ou s'ils modulent certaines pathologies.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée de façon routinière et fiable avec un stress minimal pour l'animal. Après cette procédure, des méthodes telles que la coloration au fluorochrome aminé peuvent être utilisées pour confirmer si les nerfs ont été entièrement ablésés de la peau et si l'expression des gènes est affectée.