Stencil micromodelage des pluripotentes humaines Cellules souches pour Probing Organisation spatiale des Différenciation Fates

L'objectif général de cette méthode de micropatterning basée sur un pochoir, appliquée aux cellules souches pluripotentes humaines, est de fournir un moyen simple et robuste pour générer des gradients environnementaux spatiaux contrôlant les schémas de différenciation des cellules souches. Cette méthode permet de répondre à des questions clés concernant le modelage des tissus à l’aide d’un modèle de cellules souches humaines, notamment comment les gradients spatiaux des forces d’adhésion cellule-cellule et cellule-matrice peuvent contribuer à organiser les destinées de différenciation des cellules souches. L’avantage de cette méthode réside dans le fait qu’elle ne nécessite aucune modification de surface supplémentaire pour créer des motifs d’adhésion cellulaire à la matrice extracellulaire (ECM) auxquels les cellules peuvent s’attacher.

Cela signifie que la méthode est compatible avec diverses configurations de la MEC et des substrats, spécifiques à chaque lignée cellulaire. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de micropatterning sont difficiles à apprendre, en raison de la manipulation précise et soigneuse requise pour le pochoir et les cellules.

Pour cette procédure, les pochoirs PTMS doivent déjà avoir été conçus et fabriqués. De même, faites croître des cellules EFC humaines sur une matrice de membrane basale, de sorte que les colonies soient prêtes à être ensemencées ultérieurement au cours de la procédure. Pour commencer, chargez une boîte avec 700 microlitres d'éthanol de qualité analytique à 70 % dans de l'eau ultra-pure.

Ensuite, placez le pochoir en PDMS sur la solution et mettez le plat dans une hotte de sécurité biologique pour le laisser sécher toute la nuit. Le lendemain, vérifiez qu'aucune bulle ne s'est formée sous le pochoir. Puis, préparez le plat jusqu'à ce que les cellules puissent être semées sur le pochoir.

Préparez un aliquot de matrice de membrane basale de qualité pour cellules souches embryonnaires humaines en ajoutant 16,7 millilitres de DMF12, afin d'obtenir une solution à 1,5x, et maintenez-la sur de la glace. Traitez le substrat avec un plasma d'oxygène de 100 watts pendant 90 secondes. N'ouvrez pas la boîte avant qu'elle ne soit à l'intérieur de la chambre à plasma, et recouvrez-la rapidement après le traitement.

Ce traitement empêchera la formation de bulles lorsque le substrat sera immergé dans la solution. Recouvrez ensuite le pochoir avec 450 microlitres de solution matricielle de membrane basale préparée à 1,5x. Scellez ensuite la boîte avec du parafilm et incubez pendant cinq heures.

Avant de poursuivre, examinez les plaques à six puits contenant les colonies de CESH préparées. Identifiez et aspirez les colonies de cellules différenciées ayant perdu leur morphologie typique de CESH. Elles doivent toutes présenter un aspect arrondi, une morphologie épithéliale compacte et un rapport noyau/cytoplasme élevé, avec des nucléoles apparents.

Ensuite, lavez chaque puits de cellules en plaques avec deux millilitres de DMEM/F12 deux fois. Après le deuxième lavage, ajoutez un millilitre d'enzymes digestives dans chaque puits, par exemple de l'accutase, et incubez la plaque pendant huit minutes à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, tapez doucement sur la plaque pour détacher toutes les colonies du substrat.

Ensuite, rincez chaque puits avec au moins quatre millilitres de milieu par millilitre d'enzyme digestif appliqué au puits, et recueillez les suspensions cellulaires dans un seul tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à 200 g pendant trois minutes à température ambiante pour former un culot cellulaire. Puis aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans 400 microlitres de milieu de maintenance des cellules souches embryonnaires humaines, supplémenté avec 10 micromolaire d'inhibiteur de ROCK.

Triturez doucement les cellules trois fois pour briser les agrégats. Ensuite, ajustez la densité des suspensions. Mélangez bien et préparez une dilution 1:20 de 200 microlitres dans le milieu.

Comptez les cellules dans la dilution à l'aide d'un hémocytomètre. Ensuite, diluez la suspension principale selon les besoins, en utilisant un milieu contenant l'inhibiteur de rock. Pour continuer, ajoutez le nombre requis de cellules sur chaque pochoir préparé.

Une seule monocouche de cellules doit être déposée, il faut donc les répartir uniformément. Laisser le pochoir en place sans le déranger pendant cinq minutes afin que les cellules puissent se déposer. Ensuite, transférer délicatement les pochoirs chargés dans une étuve en maintenant les boîtes parfaitement horizontales pendant tout le transfert.

Laisser les cellules s'attacher aux pochoirs pendant une heure d'incubation. Après avoir permis aux cellules de s'attacher, les examiner au microscope afin de s'assurer qu'elles l'ont fait correctement. Replacer le pochoir dans la hotte et aspirer les cellules non attachées du pochoir.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de 0,5 % de tensioactif non ionique compatible dans le DMF12 sur la zone entourant le pochoir. Faites tourner la solution pour recouvrir entièrement le pochoir. Puis, utilisez une paire de pinces stérilisées pour retirer délicatement le pochoir de la boîte.

Après avoir retiré le pochoir, examiner les cellules micropaternées au microscope. Le tensioactif non ionique empêche ces cellules de se dessécher. Laisser les cellules micropaternées incuber dans la solution de milieu enrichie en tensioactif pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius.

Après 10 minutes, aspirez la solution et lavez la plaque deux fois avec deux millilitres de milieu DMF12 normal, trois fois. Après les lavages, ajoutez deux millilitres de milieu de maintien des HESC contenant un inhibiteur de ROCK. Examinez à nouveau les cellules pour vérifier que les micropatrons se sont correctement formés.

Ensuite, incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, aspirer le milieu, laver les cellules une fois avec du DMF12, puis ajouter deux millilitres de milieu de différenciation supplémenté, afin d'induire la différenciation en mésendoderme. Analyser les résultats ultérieurement.

La fabrication du pochoir à cellules à l'aide d'une découpeuse laser a permis d'obtenir des motifs de 1000 microns. Le pochoir était composé d'une fine feuille de pochoir comportant des trous traversants micropatterningés et d'un joint en PDMS utilisé pour contenir les cellules. À l'aide de cet outil, des HESC micropatternés ont été étudiés pendant la différenciation en mésendoderme.

Les périphéries des colonies de H9-HESC présentent des adhésions par intégrines plus élevées que les cellules situées à l'intérieur de la colonie. Ainsi, ces cellules se différencient en cellules de mésendoderme brachyury T-positives lorsqu'elles sont induites avec de l'activine, de la BMP4 et du FGF2. Lorsque ces cellules étaient agencées en monocouches de différentes géométries, des angles droits et des courbures convexes géométriquement définis et isotropes ont conduit à une concentration locale des forces de traction médiées par les intégrines, entraînant une augmentation de la différenciation en mésendoderme.

L'intensité d'expression de T dans différentes régions au sein d'une colonie unique a montré que le degré d'induction du mésoderme et de l'endoderme était effectivement plus élevé dans les angles aigus des colonies carrées et rectangulaires, ainsi que sur les courbures convexes d'un arc en demi-cercle. Cela démontre que les forces mécaniques médiées par l'adhésion cellulaire peuvent être modulées à l'aide de la méthode décrite. Avant d'entreprendre la procédure, il est important d'optimiser le temps d'ensemencement de la matrice, ainsi que les durées de digestion et d'attachement des cellules, pour la lignée spécifique de cellules souches pluripotentes humaines avec laquelle vous travaillez.