Isolement de périvasculaire Multipotentes Précurseurs cellulaires Populations de Cardiac Human Tissue

L’objectif global de cette procédure est d’isoler deux populations distinctes de cellules précurseurs périvasculaires multipotentes à partir de tissu cardiaque humain. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération cardiaque, telles que la contribution apportée à ce processus par des sous-ensembles de la population de cellules périvasculaires. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle permet d’obtenir des populations de cellules progénitrices d’hétérogénéité réduite et une meilleure viabilité d’une sélection de techniques d’ex-adhésion majeures.

Cette technique peut avoir des implications dans le traitement de la cardiopathie ischémique, car il a été démontré que les sous-types de cellules souches périvasculaires ont un potentiel cardiomyogénique. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du rôle des cellules périvasculaires dans la régénération cardiaque, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres aspects des maladies cardiaques, tels que la fibrose myocardique. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à utiliser des cellules viables en raison de la fraîcheur des tissus.

Pour commencer cette procédure, après avoir retiré le péricarde, les principaux vaisseaux et les oreillettes, placez l’échantillon dans un milieu de lavage dans une boîte de Pétri. Ensuite, coupez le myocarde ventriculaire en petits morceaux d’environ un millimètre cube et traitez-les immédiatement pour obtenir le rendement cellulaire le plus élevé. Ensuite, préparez une solution de digestion fraîche et réchauffez-la à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.

Après cela, filtrez les morceaux de tissu en suspension à travers une passoire de 100 microns et lavez-les deux fois avec du PBS. Transférez les morceaux de tissu dans un récipient stérile de 30 millilitres avec un couvercle hermétiquement fermé. Ajoutez la solution de digestion et placez le récipient dans un sac en plastique scellé dans un bain-marie à 37 degrés Celsius réglé à 120 tr/min.

Après 15 minutes, retournez le récipient trois fois. Ensuite, remettez-le dans le bain-marie pendant 15 minutes supplémentaires. Ensuite, retirez et trempez les collagénases avec cinq millilitres de DMEM complété par 20 % de FBS.

Par la suite, triturez le tissu digéré en pipetant doucement 10 à 20 fois avec une pipette sérologique de 10 millilitres pour décomposer les amas de tissus. Ensuite, filtrez la suspension séquentiellement à travers des crépines à cellules de 100 microns, 70 microns et, enfin, 40 microns pour obtenir une suspension à cellule unique. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 200 x g pendant quatre minutes.

Décantez soigneusement le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges pendant deux minutes à température ambiante avant de la diluer avec quatre millilitres de produit de lavage. Répétez l’étape de centrifugation et remettez le granulé en suspension dans un millilitre de produit de lavage. Diluez 10 microlitres de suspension cellulaire avec 90 microlitres de produit de lavage pour obtenir une dilution de un à 10 de la suspension cellulaire.

Mélangez 10 microlitres de suspension cellulaire diluée avec 10 microlitres de colorant bleu trypan et placez 10 microlitres du mélange sur un hémocytomètre standard pour le comptage cellulaire. Dans cette procédure, ajoutez 50 microlitres de sérum de souris à la suspension cellulaire et incubez-la à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes pour bloquer la liaison d’anticorps non spécifiques. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 200 x g pendant quatre minutes.

Retirez le surnageant et mettez-le en suspension dans le produit de lavage. Ensuite, aliquote 50 microlitres de suspension cellulaire dans chacun des deux tubes de cytométrie à flux rond en polystyrène pour l’isotype et les témoins non colorés et placez le volume restant dans un troisième tube pour la coloration multicolore. Ajoutez cinq anticorps à la suspension unicellulaire pour une coloration multicolore.

Pipetez doucement pour mélanger les anticorps avec les cellules et incubez tous les tubes à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes dans l’obscurité. Préparez les billes de contrôle de compensation en ajoutant une goutte de billes positives à 100 microlitres de produit de lavage dans cinq tubes de cytométrie en flux. Ajoutez les anticorps individuellement dans chacun des cinq tubes.

Ensuite, incubez tous les tubes à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes dans l’obscurité. Pendant ce temps, préparez des tubes de collecte de cellules, chacun avec 500 microlitres de milieu de culture EGM-2, et placez-les à quatre degrés Celsius. Après l’incubation de l’anticorps, ajoutez cinq millilitres de produit de lavage pour laver les cellules et les billes afin d’éliminer tous les anticorps non liés.

Centrifugez tous les tubes à 200 x g pendant quatre minutes. Répétez les étapes de lavage et de centrifugation et décantez soigneusement le surnageant. Ensuite, remettez en suspension les cellules dans le milieu de lavage à une concentration de un fois 10 à 6 cellules par 250 microlitres.

Ensuite, mettez les billes en suspension dans 100 microlitres de produit de lavage. Transférez les suspensions de cellules et de billes dans le trieur de cellules sur de la glace dans l’obscurité. Ajoutez une goutte de billes négatives dans les tubes de contrôle de compensation de perle positive et utilisez-les pour régler la compensation de fluorescence.

Ensuite, exécutez les cellules de contrôle non colorées pour établir la fluorescence de fond et régler les tensions. Par la suite, exécutez les isotypes de contrôle pour établir les seuils de fluorescence de fond liés à la liaison non spécifique. Analysez l’échantillon coloré multicolore et collectez les populations de cellules péricytaires et adventicielles dans les tubes de collecte.

Dans cette procédure, ajoutez 100 microlitres de solution de gélatine stérile à 0,2 % par centimètre carré de surface de croissance et agitez manuellement pour enrober l’intégralité des puits. Après cela, incubez les assiettes à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, retirez complètement la solution de gélatine.

Conservez les cellules collectées sur de la glace pendant la préparation des plaques de culture. Ensuite, centrifugez les cellules fraîchement collectées à 200 x g pendant quatre minutes et remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans une quantité appropriée d’EGM-2. Ensuite, ensemencez les cellules sur les plaques recouvertes de gélatine.

Dans cette figure, les cellules vivantes ont été contrôlées pour exclure d’abord les cellules CD45 positives, puis les cellules CD56 positives. Les cellules endothéliales CD144 positives ont ensuite été retirées de la fraction CD56 négative. À partir de cette population finale, des péricytes CD146 positifs et CD34 négatifs et des cellules adventives CD146 négatives et CD34 positives ont été sélectionnés puis prélevés.

Les deux cultures de péricytes myocardiques et de cellules adventielles purifiés par FACS présentent une morphologie cellulaire fusiforme à étoilée. Une fois maîtrisée, cette technique prendra environ cinq heures, si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les échantillons les plus frais fourniront le meilleur rendement de cellules viables.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la cardiomyoplastie cellulaire, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l’adéquation de ces cellules dans le traitement de la cardiopathie ischémique.