Protocole pour Isoler le Cercle de souris de Willis

L'objectif général de cette procédure de dissection est d'isoler le cercle de Willis murin afin de faciliter l'étude des gros vaisseaux de la vascularisation cérébrale de la souris. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l'étude de l'expression génique vasculaire cérébrale dans diverses maladies affectant les vaisseaux cérébraux, telles que la maladie d'Alzheimer et l'angiopathie cérébrale amyloïde. Le principal avantage de cette technique est que les gros vaisseaux peuvent être isolés rapidement et facilement sans altérer leur structure.

Commencez par utiliser des ciseaux Iris pour pratiquer une incision de quatre centimètres de long dans la paroi abdominale et le péritoine d’un souris profondément anesthésiée, juste sous le bord des côtes. Ensuite, pratiquez une incision de quelques millimètres de long dans le diaphragme, puis prolongez l’incision sur toute la longueur de la cage thoracique afin d’exposer la cavité pleurale. Soulevez le sternum et pincez son extrémité avec une pince hémostatique, en appuyant la pince contre la nuque.

Ensuite, retirez soigneusement le tissu adipeux reliant le sternum au cœur. Introduisez maintenant une aiguille de perfusion de calibre 15 dans le ventricule gauche jusqu'à l'apex cardiaque, puis utilisez des ciseaux pour sectionner un des lobes du foie afin de créer une sortie pour le liquide de perfusion. Perfusez l'animal avec 25 à 50 millilitres de PBS à un débit de pompe de 2,5 millilitres par minute pendant environ dix minutes.

Le foie doit devenir pâle lorsque le sang est remplacé par du PBS. Lorsque le liquide provenant du foie est complètement clair, arrêtez la perfusion. Pour isoler le cerveau, utilisez des ciseaux Iris pour pratiquer une incision médiane le long de la peau, du cou jusqu'au nez.

Retirer la peau avec les ciseaux à iris afin d'exposer le crâne et d'éliminer tout tissu musculaire résiduel et tout tissu adipeux. Ensuite, insérer les pointes des ciseaux à iris dans un côté du foramen magnum et faire glisser délicatement les pointes le long de la surface interne du crâne jusqu'au méat auditif externe. Effectuer une incision similaire de l'autre côté du foramen magnum, puis une incision médiane le long de la surface interne de l'os interpariétal jusqu'au début de la suture sagittale.

Placer les ciseaux Iris fermés sur l'os frontal entre les yeux, au niveau de la suture sagittale, puis ouvrir les lames pour fendre le crâne en deux. À l'aide de la pince, saisir les bulbes olfactifs et utiliser les ciseaux Iris pour sectionner les connexions nerveuses situées sur la surface ventrale du cerveau. Ensuite, plonger le cerveau dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant du PBS glacé.

Pour isoler le cercle de Willis, transférez la boîte sur un sachet réfrigérant sous un microscope stéréoscopique et retournez le cerveau sur sa face dorsale afin de visualiser le cercle de Willis. Utilisez la pince fine pour saisir les artères cérébrales antérieures à la base des lobes olfactifs, puis exercez une pression pour dissocier ces artères du réseau vasculaire. Coupez les artères cérébrales moyennes de la même manière.

Ensuite, utilisez les extrémités pointues de la pince pour saisir les artères cérébrales moyennes et soulever le départ des artères communicantes postérieures, en déconnectant ainsi les deux paires d'artères du cerveau. Puis, soulevez les artères antérieures en les tirant doucement au-dessus du chiasma optique dans une direction antérieure et dorsale. Retirez les artères cérébelleuses supérieure et postérieure de la même manière, suivies du déplacement de l'artère basilaire.

Enfin, utilisez la pince pour transférer délicatement tout le cercle de Willis dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant du PBS glacé, puis fixez les vaisseaux en place à l’aide d’épingles fines, en utilisant deux pinces pour retirer soigneusement tout tissu cérébral restant. Le cercle de Willis doit sortir d’un seul tenant et présenter une légère transparence due à l’absence de sang résiduel dans la vascularisation. Le cercle de Willis propre doit exprimer spécifiquement des marqueurs des cellules musculaires lisses vasculaires, tels que l’actine des muscles lisses, la myosine lourde des muscles lisses et la smoothéline.

Les marqueurs neuronaux, tels que la glycoprotéine oligodendrocytaire de la myéline ou la protéine 2 associée aux microtubules, devraient, en revanche, être à peine détectables dans le cercle de Willis. De plus, l'expression du marqueur endothélial, E-sélectine, dans les tissus nerveux situés en dehors du cercle de Willis, est très similaire à celle observée dans les échantillons du cercle de Willis, ce qui reflète peut-être l'existence d'un réseau de capillaires cérébraux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est correctement exécutée.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les vaisseaux cérébraux de la souris sont très fins et se rompent facilement. Ainsi, la dissection doit être effectuée avec beaucoup de précaution, sans précipitation, afin de garantir que l'ensemble de la structure soit prélevée en un seul morceau. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs spécialisés dans le domaine des maladies inflammatoires du système nerveux pour explorer les troubles vasculaires cérébraux dans des modèles murins de la maladie d'Alzheimer et de maladies apparentées telles que l'angiopathie cérébrale amyloïde.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler le cercle de Willis chez une souris.