Multimodal Imaging and Platform microendoscopie Spectroscopy Fiber-bundle pour non-invasive, In Vivo L'analyse des tissus

L’objectif global de cette procédure est la caractérisation fonctionnelle des tissus in vivo en combinant des informations structurelles à haute résolution avec des données spectrales quantitatives. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du cancer, telles que la quantification des effets de la thérapie sur la microstructure et la perfusion des tissus. Le principal avantage de cette technique est qu’une seule sonde peut être utilisée pour collecter à la fois des données d’image et de spectroscopie à partir du même endroit.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement du cancer gastro-intestinal car la sonde est compatible avec les techniques d’endoscopie conventionnelles. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car de petites irrégularités dans le placement des sondes peuvent affecter considérablement l’exactitude des données. Nous avons eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons réalisé l’importance de combiner une technique d’imagerie à haute résolution avec une méthode de spectroscopie quantitative.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de préparation sont difficiles à apprendre en raison de la complexité de la construction et de l’étalonnage. Pour commencer à assembler la modalité de microscopie à fluorescence haute résolution du microendoscope multimodal, montez un miroir dichroïque de 470 nanomètres dans un cube de cage de 30 millimètres. Fixez les tiges d’assemblage de la cage à l’avant, à droite et à gauche du cube de la cage.

Fixez une bague de retenue sans tension à une plaque de cage filetée et vissez un tube de lentille dans la bague de retenue. Fixez une autre plaque de cage sur le tube de l’objectif aligné avec la première plaque de cage. Ensuite, fixez un miroir en aluminium amélioré aux UV dans un support de miroir à angle droit.

Fixez quatre tiges à l’avant du support de rétroviseur et deux tiges en diagonale sur le côté droit du support. Faites glisser l’ensemble du tube de l’objectif sur le côté gauche du cube de la cage. Connectez le côté droit de la monture de miroir à l’ensemble du tube d’objectif.

Faites glisser un support de translation de l’axe Z sur le côté droit de l’ensemble. Fixez un objectif achromatique 10x à la monture de translation. Ensuite, fixez une plaque d’adaptation fibre à une monture d’objectif de translation de l’axe XY.

Faites glisser la monture sur l’ensemble situé devant l’objectif. À l’aide de bagues de retenue, fixez un filtre d’excitation et un filtre d’émission appropriés dans les tubes de l’objectif. Vissez le tube de lentille du filtre d’excitation à l’avant du cube de la cage.

Et le tube d’objectif du filtre d’émission à l’avant de la monture du miroir à angle droit. À l’aide d’époxy, fixez une LED de 455 nanomètres à la plaque de la cage devant le filtre d’excitation. Faites glisser une plaque de cage devant chaque tube d’objectif de filtre.

À l’aide d’une bague de retenue, fixez une lentille achromatique à tube doublet dans un autre tube d’objectif de sorte que la flèche à l’extérieur de l’objectif fasse face au côté fileté à l’extérieur du tube d’objectif. Fixez la lentille du tube à la plaque de la cage gauche, placez une autre plaque de cage devant la lentille du tube. À l’aide d’un anneau de retenue sans stress, fixez une caméra monochrome USB à la plaque de la cage.

Pour commencer à assembler la méthode de spectroscopie à réflexion sub-diffuse, fixez une plaque de cage filetée à l’avant d’une source lumineuse halogène au tungstène avec de l’époxy. Insérez quatre tiges d’assemblage de cage dans la plaque de cage et faites glisser un support de translation de l’axe Z sur les tiges. Vissez un objectif achromatique 20x dans la monture de translation de l’axe Z.

Connectez une plaque d’adaptation fibre à une monture de translation de l’axe XY et faites glisser la monture sur l’ensemble situé devant l’objectif de l’objectif. Enfin, fixez les deux ensembles à une table optique proche l’un de l’autre à l’aide de dispositifs de montage appropriés. Pour commencer à construire le dispositif de commutation de séparation du détecteur de source, vissez une plaque d’adaptation de fibre SMA filetée à l’extérieur dans un bras de moteur en aluminium.

Fixez un adaptateur de bras moteur à l’arrière du bras moteur. Ensuite, vissez un moteur pas à pas dans un boîtier de moteur en aluminium. Vissez l’ensemble du bras du moteur sur la tige du moteur et serrez la vis de blocage.

Ensuite, vissez trois plaques d’adaptation à fibre dans un commutateur optique, puis vissez la plaque frontale sur le commutateur optique. Enfilez la tige du moteur pas à pas dans le trou central du commutateur optique. Placez un pilote de moteur pas à pas sur la ligne centrale d’un panneau rouge sans dégaz.

Connectez le pilote à une alimentation électrique appropriée et au moteur pas à pas. Fixez l’interrupteur optique à la table optique. Fixez un câble de raccordement de 550 micromètres 0,22 na au bras du moteur.

Connectez l’autre extrémité à un spectromètre USB. Pour connecter la sonde à fibre optique, fixez le câble central à fibre optique de 1 millimètre à l’ensemble de modalité de microscopie à fluorescence haute résolution. Fixez le câble multimode gauche de 200 micromètres à l’ensemble de la modalité de spectroscopie à réflexion subdiffuse.

En continuant à partir de la gauche, connectez les câbles multimodes restants aux adaptateurs gauche, central et droit du périphérique de commutation optique. Pour commencer l’étalonnage de l’expérience, connectez tous les périphériques USB à l’ordinateur. Allumez tous les instruments et assurez-vous que l’obturateur de la lampe halogène au tungstène est ouvert.

Ensuite, éteignez les lumières de la pièce et fermez les autres sources de lumière ambiante. Ouvrez le logiciel d’acquisition de données. Laissez l’équipement fonctionner pendant 30 minutes avant de procéder à l’étalonnage.

Placez un étalon de réflexion diffuse à 20 % dans la partie inférieure de l’appareil d’étalonnage. Insérez la sonde à fibre optique dans la fente gauche de l’appareil et réglez le commutateur optique motorisé sur la gauche pour sélectionner le micromètre 374 comme réglage DS. Dans le logiciel, réglez le temps d’intégration sur 500 millisecondes.

Cliquez ensuite sur Acquérir le spectre pour commencer l’acquisition de RMAX pour cette FDS. Une fois l’acquisition de RMAX terminée, enregistrez le spectre dans un dossier désigné. Fermez l’obturateur de la lampe halogène au tungstène et acquérez le spectre sombre R pour cette SDS.

Ouvrez l’obturateur, déplacez la sonde vers la bonne fente de l’appareil d’étalonnage et réglez le commutateur optique motorisé sur la position médiane pour le réglage SDS de 730 micromètres. Acquérez RMAX et RDARK pour cette FDS afin de terminer l’étalonnage. Tout d’abord, déterminez la zone d’habillage appropriée pour la collecte de données.

À l’aide d’un surligneur jaune comme source pyranine, colorez légèrement la zone choisie. Pour commencer la microscopie à fluorescence haute résolution, allumez la LED de 455 nanomètres et fermez l’obturateur de la lampe halogène au tungstène. Placez la sonde à fibre optique en contact doux avec la peau.

Déplacez la sonde sur le tissu coloré à la pyranine pour afficher l’architecture de l’insight du courant apical. Dans le logiciel, réglez un temps d’exposition et un gain appropriés pour éviter la saturation de l’image. Cliquez ensuite sur Acquérir l’image pour obtenir une image statique.

Maintenez la sonde en place pour la spectroscopie de réflectance sub-diffuse. Éteignez la LED de 455 nanomètres et ouvrez l’obturateur de la lampe halogène au tungstène. Ensuite, passez au réglage SDS 374 micromètres sur la gauche.

Cliquez sur Acquérir les spectres pour acquérir le spectre du tissu R pour cette SDS. Ensuite, passez à la position médiane et acquérez le spectre tissulaire SDS R de 730 micromètres. Ouvrez le logiciel de post-traitement et cliquez sur Exécuter.

Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez les spectres d’étalonnage, les spectres in vivo et l’image de fluorescence haute résolution pour obtenir l’image du tissu. La modalité de microscopie à fluorescence à haute résolution fournit une image haute résolution nette du site tissulaire. La coloration à la pyranine montre les contours individuels des kératinocytes.

Le logiciel de post-traitement utilise les données de spectroscopie de réflectance sub-diffuse pour calculer la concentration d’hémoglobine, la concentration de mélanine et la saturation en oxygène des tissus. Un naevus mélanocytaire bénin a été comparé à un tissu cutané normal voisin à l’aide de ce micro-endoscope multimodal. Le naevus mélanocytaire présentait une concentration d’hémoglobine légèrement inférieure et une concentration de mélanine légèrement élevée par rapport aux tissus normaux.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de laisser la lampe halogène au tungstène chauffer pendant 15 minutes et d’étalonner l’instrumentation avec un étalon de réflectance avant la collecte des données. À la suite de cette procédure, d’autres techniques telles que la microscopie confocale ou la microscopie multiphotonique peuvent être utilisées pour explorer les changements subcellulaires de la structure ou du métabolisme des protéines.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer la relation entre la perfusion tissulaire et la microstructure en réponse à la chimiothérapie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la construction et de l’utilisation d’un appareil hybride d’imagerie et de spectroscopie micro-endoscopique.