Caractérisation des complexes multi-unité de protéine MxA humaine utilisant dénaturant non-Gel-électrophorèse polyacrylamide

L’objectif global de cette expérience est de déterminer le nombre de sous-unités dans les complexes protéiques homooligomères dans les lysats cellulaires en utilisant l’électrophorèse sur gel de dodécosulfate-polyacrylamide de sodium non dénaturant. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, telles que le statut oligomérique des protéines impliquées dans les processus cellulaires fondamentaux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas de purification des complexes protéiques homooligomères ni d’équipement spécialisé et coûteux.

Par conséquent, il peut être effectué dans la plupart des laboratoires. Cette expérience utilise deux types de cellules. cellules A549 qui expriment la protéine A endogène de résistance aux myxovirus, ou MxA ; et des virocellules qui surexpriment MxA.

Ensemencez les cellules A549 et les virocellules dans six boîtes de puits avec deux millilitres de milieu de croissance par puits. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire. Le lendemain, récoltez les cellules.

Lavez chaque puits avec un millilitre de PBS et fixez les cellules en ajoutant 0,5 millilitre de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant environ cinq minutes à température ambiante. Dès que les cellules se détachent de la parabole, ajoutez 0,5 millilitres de milieu de croissance et mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas. Transférez les cellules de chaque puits dans un tube de deux millilitres et granulez-les à l’aide d’une centrifugeuse de table.

Retirez soigneusement le surnageant par pipetage sans déranger la pastille cellulaire. Lavez les cellules en ajoutant un millilitre de PBS glacé et en pipetant soigneusement la suspension cellulaire de haut en bas. Granulez les cellules dans une centrifugeuse de table.

Retirez délicatement le surnageant par pipetage sans détacher la pastille de cellule. Ajoutez 200 microlitres de tampon de lyse glacé, remettez les cellules en suspension en les pipetant de haut en bas, puis placez-les sur de la glace. Protégez immédiatement le lysat de la lumière en recouvrant les tubes de papier d’aluminium, car l’iodoacétamide contenu dans le tampon de lyse est sensible à la lumière.

Incuber sur glace pendant 30 minutes. L’utilisation de l’iodoacétamide est cruciale car l’iodoacétamide protège de manière irréversible le groupe thiol des cystéines libres en formant une liaison thioéther et empêche l’agrégation artificielle des protéines. Ensuite, retirez les débris cellulaires par centrifugation dans une centrifugeuse de table pré-réfrigérée.

Pendant la centrifugation, préparez des colonnes de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 10 000. Fixez les colonnes de dialyse à une bouée flottante et placez-les dans un bécher rempli d’un tampon de dialyse pré-refroidi pour équilibrer les colonnes. Ne touchez pas la membrane.

Placez un agitateur magnétique dans un bécher et transférez le bécher dans la chambre froide. À l’aide de l’agitateur magnétique pour assurer une agitation douce, équilibrez pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après 20 minutes, retirez les colonnes du tampon de dialyse et de la bouée flottante.

Transférez les lysats clairs dans les colonnes de dialyse préparées par pipetage sans toucher la membrane. Fixez les colonnes à une bouée flottante. Remettez-les dans le bécher rempli de tampon de dialyse, puis transférez le bécher dans la chambre froide.

Dialysez le lysat pendant au moins quatre heures à quatre degrés Celsius tout en remuant soigneusement avec un agitateur magnétique pour éliminer les petits métabolites et sels qui pourraient interférer avec l’électrophorèse en gel de polyacrylamide non dénaturant. Une fois la dialyse terminée, transférez chaque échantillon dialysé dans un tube de 1,5 millilitre. Éliminer les précipités par centrifugation dans une centrifugeuse de table.

L’électrophorèse doit être réalisée immédiatement après la dialyse des lysats pour éviter la dissociation des complexes protéiques oligomères. Remplissez la chambre de gel intérieure et extérieure avec un tampon de coulée pré-réfrigéré. Pré-exécutez le gel de polyacrylamide non dénaturant avec un tampon de fonctionnement pré-refroidi à 25 milliampères par gel pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Mélangez 15 microlitres de lysat préparé avec cinq microlitres de tampon d’échantillon 4X. Chargez un étalon de protéine native de votre choix et 15 microlitres d’échantillon sur le gel. Faites fonctionner le gel à 25 milliampères pendant quatre heures à quatre degrés Celsius.

Lorsque l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturant est terminée, démontez le gel et transférez-le soigneusement dans le tampon SDS. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante en secouant doucement. Préparez deux éponges, quatre feuilles de papier filtre en cellulose et une membrane buvard par gel et trempez-les dans un tampon buvard.

Assemblez le sandwich comme suit de bas en haut. Une éponge, deux feuilles de papier filtre en cellulose, une membrane buvard, le gel, deux feuilles de papier filtre en cellulose et une éponge. Mettez le sandwich dans le réservoir de buvard, en vous assurant que la membrane fait face au pôle positif, tandis que le gel fait face au pôle négatif.

Remplissez le réservoir de buvard avec un tampon de transfert pré-réfrigéré. Pour obtenir les meilleurs résultats de transfert de protéines, épongez à 90 milliampères pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, démontez le sandwich.

Incuber la membrane dans la solution de Ponceau S pendant cinq minutes à température ambiante pour visualiser l’étalon protéique. Détachez la membrane en la plaçant dans de l’eau déminéralisée et en la lavant. Après avoir transféré la membrane dans un plateau, marquez les bandes de l’étalon protéique à l’aide d’un stylo.

Bloquez la membrane avec un tampon de blocage pendant au moins une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Par la suite, les protéines d’intérêt sont visualisées par immunomarquage à l’aide d’un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre MxA comme décrit dans le protocole textuel. Les virocellules dépourvues de MxA endogène ont été transfectées avec une MxA de type sauvage recombinant et une variance MxA monomère et dimérique.

La migration de la variance MxA recombinante à leur poids moléculaire attendu a confirmé leur état oligomérique. Le type sauvage MxA, exprimé de manière ectopique, a migré sous forme de tétramère. Ces protéines recombinantes ont ensuite été utilisées pour évaluer l’état oligomérique de la protéine MxA humaine endogène dérivée de cellules A549 stimulées par l’interféron alpha.

Le résultat a révélé que la taille de MxA dans les lysats de cellules A549 stimulées par l’interféron alpha correspond à un tétramère. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en un jour et demi si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de ne pas geler et décongeler les échantillons pendant toute la procédure, car cela pourrait détruire les interactions protéiques ou provoquer des agrégations de protéines.

De plus, lorsque vous travaillez avec des réactifs sensibles à la lumière, comme l’iodoacétamide, il est important de protéger les échantillons de la lumière pendant l’étape de lyse. Suite à la SDS-PAGE non dénaturante, d’autres méthodes telles que l’extraction sur gel de protéines et l’activité enzymatique AsiS ou une PAGE de seconde dimension peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’activité enzymatique et la caractérisation de complexes hétéro-oligomères potentiels. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer la composition des complexes protéiques oligomères dans les cellules cultivées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des lysats cellulaires à partir de cultures cellulaires pour étudier les protéines oligomères dans l’analyse PAGE non dénaturante. N’oubliez pas que travailler avec l’iodoacétamide peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et une protection oculaire doivent toujours être prises.