L'immunohistochimie sur coupes en paraffine d'épiderme de souris en utilisant des anticorps fluorescents

Dans l'épiderme. L'immunohistochimie est un moyen efficace de localiser des protéines spécifiques dans leur compartiment d'expression. Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode fiable pour l'immunolocalisation de protéines dans l'épiderme, que nous utilisons couramment dans notre laboratoire.

Bonjour, je suis Tammy du laboratoire du Dr Turin, situé dans l'aile basse de l'Institut de recherche en santé d'Ottawa, programme des maladies chroniques. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'immunohistochimie utilisant des anticorps fluorescents sur des coupes de tissus inclus en paraffine d'épiderme de souris. Dans notre laboratoire, nous avons optimisé des protocoles pour la localisation immunohistochimique de marqueurs de différenciation épidermique à l'aide de tissus fixés au BO'S.

Dans le cadre de l'optimisation, nous maintenons la peau à plat en la disposant sur du papier absorbant avant la fixation. Cette procédure comprend la dissection, la fixation de l'épiderme, la déshydratation, l'inclusion en paraffine, la coupe des sections, le déparaffinage, la réhydratation, la démasquage des antigènes, le marquage par anticorps, puis enfin la monture et la visualisation en fluorescence épiscopique. Commençons donc.

Lorsque vous utilisez des souriceaux néonatals, il n'est pas nécessaire de raser la peau du dos. Toutefois, lorsque vous travaillez avec des souris plus âgées dotées d'un pelage, vous devez raser la peau du dos afin qu'elle n'entrave pas la coupe des sections. Lorsque vous effectuez votre dissection, veillez à ne pas insérer vos pinces dans les zones de la peau que vous souhaitez utiliser pour votre test.

Ce que nous faisons, c'est simplement placer la pince autour du bord de l'endroit où nous allons découper, puis soulever très délicatement et inciser l'épiderme, en veillant à ne pas toucher la zone que vous souhaitez utiliser pour votre expérience. Lorsque nous fixons la peau, nous ne voulons pas qu'elle s'enroule et se retrouve en boule dans le tube. Nous voulons qu'elle reste bien plate.

Ce que nous faisons pour faciliter cette étape consiste à placer la peau sur une serviette en papier afin qu'elle reste bien plate pendant la fixation. Maintenant que la peau est bien à plat sur la serviette en papier, nous coupons les bords ou les taillons afin d'éliminer les parties qui auraient pu être endommagées par la pince. Ensuite, vous découpez la peau en très petits morceaux d’environ deux millimètres sur deux millimètres.

Le tissu va maintenant être fixé. Après avoir découpé la peau en morceaux de taille pratique, immergez-la dans la solution boin. Bouchonnez les tubes, enveloppez-les avec du perfil et placez-les sur un agitateur rotatif.

Pour une incubation nocturne, il est important d'incuber uniquement dans la solution boin pendant 16 à 18 heures. Des périodes de fixation plus courtes ou plus longues endommageront votre tissu. L'incubation est terminée.

Vous rincez votre tissu avec du PBS, puis effectuez une série de lavages à l'éthanol en utilisant de l'alcool à 30 %, 50 % et 70 %. Vous pouvez observer que le BO est de couleur jaune et que, lors des lavages, au fur et à mesure que le BO est dilué, la couleur du liquide de lavage devient de moins en moins jaune. Vous effectuez deux lavages de 30 minutes chacun.

Après le dernier lavage dans l'échantillon d'éthanol, ceux-ci sont placés dans de l'éthanol à 70 % frais et peuvent être conservés à quatre degrés Celsius jusqu'au traitement ultérieur, quelques aérations de paraffine. Inclusion. L'utilisation excessive de tissus congelés réside dans le fait que l'intégrité tissulaire est supérieure et que les échantillons peuvent être stockés pendant de longues périodes. En général, les plateformes techniques produisent des résultats plus reproductibles.

Cependant, si vous disposez des installations adéquates et d'un opérateur spécialisé compétent, les sections peuvent être réalisées en interne. Apprendre à couper de bonnes sections relève davantage d'un art. Par conséquent, nous utilisons une plateforme mutualisée.

Après avoir récupéré les lames du laboratoire central, vous pouvez constater que la paraffine est présente sur les lames. Sous forme de film mince, les lames sont placées sur un porte-lames enveloppé de papier d'aluminium, comme une pomme de terre cuite au four, puis incubées cinq minutes à 55 degrés. Une fois l'incubation terminée, déballez rapidement les lames et placez-les dans du toluène pour trois rinçages de cinq minutes.

Il est très important de bien respecter le temps de cinq minutes pour ces lavages, car une incubation trop longue nuirait à vos échantillons en présence de toluène. Après vos trois lavages et le toluène, effectuez un rinçage rapide dans de l'éthanol à cent pour cent. Étant donné que l'éthanol et le toluène forment un précipité qui pourrait interférer avec votre expérience, cette étape est très importante à ne pas oublier.

Ensuite, les échantillons sont réhydratés en incubant les lames pendant cinq minutes dans de l'éthanol à 95 %, cinq minutes dans de l'éthanol à 70 %, puis deux fois cinq minutes dans l'eau. À ce stade, les tissus peuvent être traités pour une coloration avec l'hématoxyline et l'éosine (h et e). Nous utilisons également la plateforme mutualisée à cette fin.

Pour le démasquage de l'antigène, versez 500 ml de tampon citrate une fois dans un bécher en plastique d'un litre et immergez vos lames. N'oubliez pas d'enlever la poignée métallique et placez votre bécher au micro-ondes. Chauffez au micro-ondes à puissance maximale deux fois cinq minutes.

Pensez à ouvrir la porte du micro-ondes entre vos deux incubations afin de le refroidir. Une fois le traitement au micro-ondes terminé, retirez les lames du tampon citrate bouillant et placez-les dans un récipient de coloration contenant de l'eau tiède. Nous utilisons simplement de l'eau du robinet tiède, dont le but est de refroidir progressivement vos lames de la température d'ébullition à la température ambiante.

Vous pouvez maintenant laver les lames trois fois pendant cinq minutes dans du PBS et nous sommes prêts à commencer l'immunohistochimie. La première chose que nous devons faire pour débuter la coloration immunologique est de sécher la zone autour de nos échantillons à l’aide d’un morceau de papier absorbant. Afin d’éviter la contamination croisée des anticorps, nous délimitons la zone entourant nos échantillons à l’aide d’un bloqueur liquide.

Préparez une chambre humidifiée en plaçant un papier filtre dans une boîte de Pétri. Imbibez-le d'eau, retirez l'excès d'eau, puis insérez vos lames. La raison pour laquelle nous utilisons une chambre humidifiée est de s'assurer que, pendant les périodes d'incubation, nos lames ne s'assèchent pas.

Il est très important que les lames ne sèchent pas, car cela augmenterait votre fond. Les lames sont bloquées à ce stade avec le tampon d'incubation pendant 30 minutes. Après le blocage, transférez vos lames dans le porte-lames et incubez-les dans le tampon de lavage.

Éliminez l'excès de tampon comme vous l'avez fait précédemment. Replacez la lame dans la chambre humidifiée et incubez avec l'anticorps primaire pendant une heure, à température ambiante.

Lorsque votre incubation d'une heure est terminée, replacez les lames dans le porte-lames et rincez-les trois fois avec du tampon de lavage pendant 10 minutes chacun. Après les lavages, retirez l'excès de tampon de lavage autour de votre échantillon à l'aide d'un papier absorbant. Replacez les lames dans la chambre humidifiée et incubez pendant une heure à température ambiante avec l'anticorps secondaire. Après l'incubation avec l'anticorps secondaire, effectuez un lavage en trois changements de tampon de lavage, de 15 minutes chacun.

Ensuite, nous effectuons trois lavages de cinq minutes chacun. Dans du PBS, éliminez tout liquide excédentaire entourant l'échantillon et essuyez le PBS à l'arrière de la lame avant de monter les lamelles sur la lame. Nous utilisons un mélange contenant 2,5 % de DAB.

Afin de réduire la décoloration, ajouter 80 microlitres goutte à goutte sur les lames en prenant soin de ne pas introduire de bulles. Puis abaisser très lentement une lamelle de couvre-objet.

Veillez à ne laisser aucune bulle. Les bulles sont néfastes car elles se forment souvent directement sur votre spécimen, précisément là où vous souhaitez prendre vos images une fois que votre montage est sec. Vous êtes maintenant prêt. Examinez vos lames.

Voici un exemple de coloration réussie utilisant un filtre FITC. Avec un objectif 20 x, on observe la claudine six associée à toutes les couches basales supérieures de l'épiderme. Notre laboratoire s'intéresse particulièrement à l'expression et à la localisation des claudines dans l'épiderme.

En ce qui concerne les jonctions serrées et la formation de la barrière de perméabilité épidermique, nous venons de vous montrer comment réaliser une immunohistochimie sur la peau de souris. Lors de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que vos coupes tissulaires doivent être bien plates et que vous devez vous assurer que vos lames ne s'assèchent pas entre les incubations. Voilà, c'est tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.