Détection et enrichissement des rares cellules B spécifiques de l'antigène pour l'analyse des Phénotype et fonction

Le but global de cette procédure simple mais efficace est d'isoler et d'enrichir des lymphocytes B rares liant l'antigène à partir du sang périphérique humain, en utilisant des nanoparticules magnétiques pour leur analyse phénotypique et fonctionnelle. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie concernant le phénotype et la biologie des lymphocytes B rares liant l'antigène, tant avant qu'après la rencontre in vivo avec l'antigène. Le principal avantage de cette technique est qu'elle élimine les problèmes liés à la géométrie, notamment lorsqu'on utilise une plaque en styrène ou une grosse bille.

Et cela élimine les problèmes liés au débit lorsqu'on isole des cellules par cytométrie en flux afin d'isoler des cellules rares au sein de populations cellulaires initiales assez importantes. Immédiatement après avoir prélevé 30 à 50 millilitres de sang total dans des tubes de prélèvement sanguin héparinés, mélanger le sang selon un ratio de 1:1 avec du PBS stérile, sans magnésium ni calcium, à température ambiante. Ensuite, déposer délicatement le mélange sanguin en couche supérieure sur 10 millilitres de solution de gradient de densité à température ambiante, dans un tube conique stérile de 50 millilitres, en utilisant une pression lente et constante sur la poire de pipetage.

Séparer les cellules par centrifugation. Éliminer la couche supérieure contenant le plasma et les plaquettes, puis utiliser une pipette stérile pour transférer le culot de cellules mononucléées, appelé couche de Défense, dans un nouveau tube stérile de 50 millilitres. Remplir le tube avec jusqu'à 50 millilitres de PBS afin de laver les cellules mononucléées par centrifugation.

Ensuite, resuspendre le culot dans 10 millilitres de PBS frais pour le comptage et ajuster la concentration cellulaire à 1x10^7 cellules par millilitre dans du PBS frais sur glace. Pour marquer les cellules en vue de la liaison à des billes magnétiques, transférer d'abord des aliquotes de 1-2x10^6 cellules dans des tubes en polystyrène de 5 millilitres, pour chaque contrôle de compensation de fluorescence et de type Fluorescence Minus One, selon les besoins. Ensuite, récupérer le reste de l'échantillon cellulaire par centrifugation et resuspendre le culot à une concentration de 3-6x10^7 cellules par millilitre dans du tampon FACS stérile filtré et froid.

Répartir équitablement la solution cellulaire dans quatre tubes FACS placés sur de la glace et ajouter le réactif de blocage du récepteur Fc gamma humain à ces quatre fractions d'échantillons expérimentaux. À la fin de l'incubation de blocage de la liaison non spécifique, ajouter les anticorps marqués par fluorescence appropriés pour la coloration de la surface cellulaire aux cellules des quatre fractions d'échantillons. Ensuite, ajouter l'antigène biotinylé approprié aux fractions A et D, puis ajouter un volume suffisant d'antigène non marqué à la fraction B de manière à bloquer la majorité des récepteurs ayant une affinité d'au moins 1x10^6 molaire.

Incuber tous les échantillons pendant 30 minutes sur de la glace, puis effectuer une incubation de 30 minutes de la fraction B avec l'antigène biotinylé approprié. À la fin des incubations, laver les cellules deux fois dans un millilitre de tampon FACS froid par 5x10^7 cellules. Resuspendre ensuite les culots dans un millilitre de formaldéhyde à 2 % par 5x10^7 cellules pendant cinq minutes à l'abri de la lumière sur de la glace.

Après la fixation, laver les cellules deux fois supplémentaires comme vient d'être démontré. Resuspendre ensuite les culots dans un millilitre de tampon FACS frais et glacé par 5x10^7 cellules. Incuber ensuite les cellules avec un à deux microgrammes d'anticorps secondaire conjugué à la streptavidine approprié pendant 20 minutes à l'abri de la lumière sur glace, puis laver les cellules deux fois supplémentaires.

Pour l'enrichissement à base de nanoparticules magnétiques, resuspendre les fractions cellulaires A, B et C dans un millilitre de tampon de séparation froid par 5x10^7 cellules et filtrer les cellules à travers des filtres individuels de 40 microlitres afin d'éliminer tous les agrégats. Ensuite, ajouter les nanoparticules marquées avec le colorant fluorescent à la concentration appropriée pendant 10 minutes à l'obscurité à quatre degrés Celsius avec agitation rotative, puis laver les échantillons deux fois dans un millilitre de tampon de séparation froid. Resuspendre les culots dans un millilitre de tampon de séparation froid par 5x10^7 cellules.

Ensuite, équilibrez trois colonnes magnétiques sur leurs aimants de taille appropriée avec trois millilitres de tampon de séparation chacune, en laissant l'ensemble du volume de tampon de séparation traverser chaque colonne et s'écouler dans un récipient de déchets. Placez maintenant un tube conique de 15 millilitres étiqueté sous chaque colonne et ajoutez les cellules marquées par des particules magnétiques sur leurs colonnes respectives. Lorsque l'ensemble du volume de chaque fraction cellulaire a traversé chaque colonne, ajoutez trois millilitres de tampon de séparation frais glacé au sommet de chaque colonne, en récupérant les effluents dans les tubes étiquetés.

Une fois que le deuxième lavage a complètement traversé les colonnes, placez les tubes contenant les cellules sélectionnées négativement de chaque fraction sur de la glace et transférez les colonnes dans de nouveaux tubes de 15 millilitres pour chaque fraction. Remplissez chaque colonne avec environ six millilitres de tampon de séparation frais et faites immédiatement passer le tampon à travers les colonnes afin de récupérer les cellules liées magnétiquement. Ensuite, récupérez les deux fractions cellulaires, positive et négative, par centrifugation et remettez en suspension les culots dans la solution appropriée pour l'analyse en aval prévue.

Dans ces graphiques, la fréquence des cellules B réactives au toxoïde tétanique provenant d’un individu ayant reçu son dernier vaccin contre le tétanos il y a plus de dix ans illustre la capacité de cette méthode à enrichir environ sept fois les cellules se liant au toxoïde tétanique, avec une pureté d’environ 4 %. L’ajout d’un excès de 50 fois de toxoïde tétanique non marqué aux cellules provenant d’un sujet vacciné environ trois ans avant le prélèvement sanguin, avant l’ajout de l’antigène biotinylé, réduit la liaison au toxoïde tétanique de 83 %, démontrant ainsi la spécificité de la liaison de l’antigène. Lorsque l’antigène biotinylé est omis lors de la procédure, seulement 0,2 % des cellules B se lient encore, reflétant vraisemblablement la liaison de certains antigènes non tétaniques dans l’adsorbant.

Ces graphiques montrent comment la fréquence des cellules B naïves spécifiques de l'anatoxine tétanique, provenant d'un échantillon sanguin prélevé sept jours après la vaccination de rappel d'un sujet sain, diminue de 84 % à 64 % après le rappel. Parallèlement, le pourcentage des populations de cellules B mémoires et de plasmablastes augmente respectivement de 16 % à 36 % et de zéro à 40 %. De plus, des données représentatives de test ELISPOT provenant d'un échantillon de sang périphérique obtenu sept jours après le rappel chez un sujet sain illustrent l'enrichissement par un facteur quatre de la fréquence des cellules sécrétant des anticorps anti-anatoxine tétanique, observé dans les cellules B liant l'anatoxine tétanique isolées.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures environ, en incluant toutes les contrôles appropriés. La méthode peut être combinée à des tests secondaires, par exemple, le transfert de cellules dans des receveurs adoptifs pour des études ultérieures du destin et de la fonction cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler et enrichir des cellules B rares liant un antigène à partir du sang périphérique humain en utilisant les contrôles adéquats.