Quantification des molécules d'endosome et de lysosome dans les neurones cultivés utilisant des sondes fluorescentes

L’objectif global de cette analyse d’imagerie est d’observer la motilité des vésicules dans les neurones et de la quantifier facilement. Cette approche permet d’analyser le trafic membranaire dans les neurones de manière simple et rapide. Pour commencer cette procédure, transférez l’utérus dans une nouvelle boîte de Pétri avec 70 % d’éthanol.

Ensuite, transférez l’utérus dans une autre boîte de Pétri avec HBSS. Retirez ensuite les fœtus de l’utérus à l’aide d’une pince à dissection stérilisée et de ciseaux chirurgicaux. Après cela, placez-les dans une nouvelle boîte de Pétri avec HBSS.

À l’aide d’un stéréomicroscope, retirez la peau et les crânes et retirez les cerveaux à l’aide de la pince à dissection stérilisée. Ensuite, transférez-les dans une autre boîte de Pétri avec HBSS. Retirez les méninges à l’aide d’une pince à dissection stérilisée.

Coupez ensuite les régions supplémentaires. Ensuite, transférez les cortex dans une nouvelle boîte de Pétri avec HBSS. Prélevez tous les cortex à l’aide d’un compte-gouttes jetable ou d’une pipette de 25 millilitres et placez-les dans un tube de 15 millilitres.

Ensuite, retirez le HBSS par pipetage. Ensuite, ajoutez trois millilitres de solution d’enzymes corticales cérébrales dans le tube contenant les cortex. Placez le tube dans un bain-marie et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Après cela, ajoutez encore trois millilitres de solution d’enzymes corticales cérébrales dans le tube contenant les cortex et incubez-les à 37 degrés Celsius dans un bain-marie pendant cinq minutes supplémentaires. Après cinq minutes, retirez la solution d’enzymes corticales cérébrales et ajoutez cinq millilitres de DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal. Dissociez les cortex en pipetant doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette de cinq millilitres avec un embout P1000 stérile.

Ensuite, pipetez à nouveau les cortex à l’aide d’une pipette de cinq millilitres avec une pointe P200. Placez une crépine en nylon de 40 micromètres sur un tube de 50 millilitres et filtrez la suspension pour éliminer les débris. Ensuite, centrifugez la suspension à 420 fois g pendant cinq minutes à température ambiante, puis retirez le milieu DMEM.

Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture cortical cérébral et remettez doucement en suspension la pastille cellulaire. Comptez ensuite les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la concentration cellulaire à l’aide du milieu de culture cortical cérébral. Ensuite, plaquez trois fois 10 aux six neurones corticaux dans deux millilitres de suspension cellulaire pour chaque plat à fond de verre codé de 35 millilitres.

Dans cette procédure, mélangez quatre microgrammes de plasmide avec 200 microlitres de milieu sans sérum. Dans un tube séparé, diluez huit microlitres de réactif de transfection dans 200 microlitres de milieu sans sérum. Ensuite, incubez la solution pendant cinq minutes à température ambiante.

Après cinq minutes, mélangez la solution plasmidique et la solution de réactif de transfection et incubez le mélange pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez le mélange dans les plats à fond de verre codés. Incuber les neurones à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, remplacez le milieu par deux millilitres de milieu de culture corticale cérébrale et incubez les neurones à 37 degrés Celsius pendant un à deux jours. Pour l’imagerie, utilisez un microscope à fluorescence équipé d’une caméra CCD avec un objectif 40X. Maintenez la température à 37 degrés Celsius à l’aide d’un système d’incubation.

Acquérez des images de neurones à raison d’une image toutes les cinq secondes sur une période de 100 secondes contrôlée par le logiciel d’acquisition d’images. Pour analyser les images, ouvrez toutes les images séquentielles dans le logiciel ImageJ avec suivi manuel. Pour combiner les images séquentielles, choisissez Image, puis Piles, puis Images à empiler, puis cliquez sur OK. Après cela, choisissez Plugins puis Suivi manuel.

Une fenêtre de suivi s’affichera. Cliquez sur la case à cocher Afficher les paramètres et définissez les paramètres de suivi dans la section Paramètres. Cliquez ensuite sur Ajouter une piste pour démarrer une nouvelle piste.

Après avoir déterminé les vésicules d’intérêt, cliquez sur le centre des signaux dans les images séquentielles pour enregistrer les coordonnées xy. Répétez cette procédure pour collecter les coordonnées xy des vésicules à partir de toutes les images séquentielles, chaque image passe automatiquement à l’image successive après la sélection du point de référence. Cette image montre la motilité des vésicules contenant LAMP-EGFP dans les dendrites des neurones corticaux de souris après deux jours de transfection, commencée à quatre DIV.

L’encart montre l’image en accéléré des vésicules positives de LAMP-EGFP. La pointe de flèche rouge indique une vésicule en mouvement et la pointe de flèche bleue indique une vésicule au repos. Les pointes de flèche orange indiquent des signaux fluorescents plus élevés.

Voici la position de l’axe X en fonction du temps des vésicules positives LAMP-EGFP. La vésicule du cercle rouge, étiquetée b, se déplace et la vésicule du cercle bleu, étiquetée a, est au repos. Ce graphique à barres indique la distance totale du mouvement LAMP-EGFP.

Et ce graphique à barres indique la distance moyenne de motilité d’une LAMP-EGFP contenant des vésicules.