Une méthode d'agrégation cellulaire efficace et flexible pour 3D Spheroid production

NARRATEUR L’objectif global de cette méthode est de générer efficacement de grandes quantités de sphéroïdes cellulaires robustes par agrégation cellulaire pour leur utilisation dans une variété d’essais cellulaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise une matrice hydrosoluble non protéique pour l’agrégation cellulaire et la formation de sphéroïdes, ce qui permet une isolation facile et rapide des sphéroïdes. Cette méthode peut aider à recueillir de nouvelles connaissances en biologie cellulaire sur les effets des interactions cellule-cellule et cellule/matrice sur la croissance tissulaire dans un microenvironnement tridimensionnel.

NARRATEUR Avant de préparer les agrégats, chauffez 50 millilitres d’eau ultrapure à 80 degrés Celsius et ajoutez 10 grammes de poudre de méthylcellulose. Agitez la suspension jusqu’à ce que les particules soient uniformément dispersées. Ajoutez ensuite de l’eau froide ultrapure à un volume final de 100 millilitres et stockez les particules pendant la nuit à 4 degrés Celsius jusqu’à ce que la solution devienne claire et de couleur paille sans solides visibles.

Passez la solution à travers un filtre de 0,45 micromètre pour éliminer tous les fragments non dissous, et diluez 1:5 milligrammes par millilitre de la solution filtrée dans le milieu de culture approprié. Filtrez ensuite le milieu enrichi en méthylcellulose à travers une passoire de 0,22 micromètre. Ensuite, dans une enceinte de sécurité biologique, lavez une sous-culture confluente à 70 % avec du PBS et fixez les cellules avec trois millilitres de tampon d’association trypsine-EDTA dans un incubateur de culture cellulaire.

Après quelques minutes, inspectez les cellules au microscope optique à un grossissement de 10x. Lorsque les cellules se sont détachées de la plaque, neutralisez la réaction avec sept millilitres de milieu de culture supplémenté en sérum. Transférez la solution cellulaire dans un tube frais de 15 millilitres, puis récupérez les cellules libérées par centrifugation.

La cause la plus fréquente de l’échec de la formation d’un sphéroïde, outre la contamination des particules, est l’utilisation de concentrations sous-optimales de méthylcellulose ou de sérum pour l’agrégation et la croissance de votre lignée cellulaire spécifique. NARRATEUR-À l’aide d’une micropipette P1000 avec une pointe filtrante, triturez la palette trois à cinq fois avec un millilitre de milieu de formation de sphéroïde, en pressant la pointe de la pipette contre le fond du tube à un léger angle, tout en pipetant lentement sans expulser tout le contenu de la pointe pour translucider la pastille. Après le comptage, diluez la suspension cellulaire à une fois 10 à une concentration de quatre cellules par millilitre, et rincez un réservoir de pipette multicanaux stérile avec de l’eau ultrapure filtrée pour éliminer toute poussière et fibres.

Distribuez les cellules dans le réservoir et utilisez des pointes filtrantes pour transférer 100 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque répulsive cellulaire à fond en U de 96 puits, en mélangeant périodiquement la suspension cellulaire pour empêcher les cellules de se déposer au fond du réservoir. Lorsque toutes les cellules ont été installées, placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire et inspectez quotidiennement les puits pour détecter la formation de sphéroïdes. Les cellules doivent se déposer au fond de chaque puits dans les six heures, et généralement s’agréger en un sphéroïde dans les 24 à 48 heures.

Pour confirmer la formation d’un sphéroïde réussi, utilisez une pointe P10 sous un microscope optique pour pipeter doucement le milieu sur le sphéroïde. Les sphéroïdes correctement formés se détacheront de la plaque et rouleront, confirmant leur structure 3D. Pour incorporer les sphéroïdes dans le collagène, utilisez le pipetage inversé pour enrober uniformément le fond de chaque puits d’une lame de chambre de culture tissulaire à huit puits avec un minimum de 50 microlitres de collagène neutralisé par puits.

Lorsque tous les puits ont été couverts, placez la lame de la chambre dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres remplie d’eau ultrapure dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres et incubez la boîte de culture tissulaire de 10 centimètres à 37 degrés Celsius pendant environ une heure. Lorsque le collagène s’est polymérisé, utilisez un embout filtrant P1000 pour transférer soigneusement les sphéroïdes préformés dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Il est essentiel que les couches de base du collagène soient incubées jusqu’à ce qu’elles soient complètement polymérisées pour éviter de perturber le collagène lors de l’ajout des sphéroïdes ou du milieu.

Recueillez les sphéroïdes récoltés dans une microcentrifugeuse de table et utilisez une pipette P200 pour éliminer les surnageants, en évacuant tout excès de surnageant par inversion de tube sur une serviette en papier propre si nécessaire. À l’aide d’une pointe de pipette P200 de large calibre, remettez immédiatement les sphéroïdes en suspension dans 50 microlitres de collagène neutralisé et transférez soigneusement les mélanges de collagène sphéroïde dans chaque puits de la lame de la chambre de culture tissulaire à huit puits. Remettez la lame dans l’incubateur jusqu’à ce que le collagène soit polymérisé.

Après environ une heure, ajoutez lentement au moins 100 microlitres de milieu de culture chauffé contenant le traitement d’intérêt approprié à chaque puits pour une autre incubation. Ensuite, utilisez un microscope à fluorescence pour acquérir des coupes d’imagerie optique à travers les sphéroïdes envahisseurs. En utilisant ce protocole, les sphéroïdes peuvent être générés à partir d’une variété de lignées cellulaires.

Dans les conditions appropriées de traitement à la méthylcellulose et au sérum, les cellules individuelles se déposent et adhèrent ensemble au centre du puits pour former des sphéroïdes avec une adhérence minimale au fond du puits. Certaines lignées cellulaires sont capables d’adhérer à des plaques répulsives cellulaires en l’absence ou à de faibles concentrations de méthylcellulose, ce qui entraîne la formation d’un sphéroïde entouré d’une monocouche cellulaire. En général, des concentrations plus élevées de méthylcellulose empêchent les cellules d’adhérer au puits.

Mais une concentration trop élevée de méthylcellulose réduit l’adhésion de cellule à cellule et empêche les cellules de se déposer au fond du puits, ce qui entraîne la formation d’agrégats lâches et de nombreux sphéroïdes satellites. Les sphéroïdes enrobés de collagène peuvent être traités avec un chimioattractant pour induire l’invasion des cellules individuelles vers l’extérieur du sphéroïde dans la matrice environnante. Les sphéroïdes fixes enrobés de collagène peuvent être imagés par microscopie à fond clair pour quantifier la distance et le nombre de cellules envahissantes, ou par microscopie d’immunofluorescence pour visualiser les structures invasives formées par les cellules migratrices.

Il est important de laisser suffisamment de temps aux cellules pour s’agréger en sphéroïdes structurellement solides, suffisamment robustes pour être manipulés sans se fragmenter, et qui peuvent être facilement collectés pour être utilisés dans des essais ultérieurs. Notre protocole de croissance cellulaire peut être adapté à plusieurs tests de biologie cellulaire. Par exemple, l’installation des cellules dans des milieux enrichis de fortes concentrations de méthylcellulose peut être utilisée pour évaluer la résistance cellulaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des sphéroïdes cellulaires tridimensionnels par agrégation, ce qui sera un outil précieux pour de nombreuses applications de biologie cellulaire.