Flash et Gel: Une nouvelle technique pour capturer la membrane dynamique avec la microscopie électronique

L'objectif général de cette procédure est de capturer la dynamique membranaire par microscopie électronique après l'induction de l'activité neuronale à l'aide de l'optogénétique, puis de congeler les cellules à des points temporels définis après la stimulation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences et en biologie cellulaire concernant les mécanismes de recyclage des vésicules synaptiques et éventuellement à modéliser ces processus à une échelle de temps très rapide. Le principal avantage de cette technique réside dans la capacité à visualiser les changements morphologiques au sein d'une cellule par microscopie électronique à l'échelle de la milliseconde.

La procédure sera démontrée par Shuo Li, étudiante diplômée, et Sumana Raychaudhuri, chargée de recherche. Toutes deux de mon laboratoire. Avant de préparer le fixateur, étiquetez deux tubes cryogéniques de un millilitre au crayon selon les numéros de spécimen.

Ensuite, mélanger tous les réactifs de fixation et aliquoter un millilitre de volume de fixateur dans chaque flacon. Après avoir bouché les tubes, plonger immédiatement les fixateurs dans de l'azote liquide et conserver les flacons dans une boîte en polystyrène fermée. Puis, remplir une unité automatisée de substitution par congélation et un congélateur à haute pression avec de l'azote liquide.

Ensuite, placez un petit récipient contenant de l'acétone dans la chambre d'échantillons de l'unité de substitution et attendez que la température de l'unité atteigne moins 90 degrés Celsius. Pour programmer le protocole de stimulation lumineuse, cliquez sur « Modifier » dans la fenêtre de stimulation lumineuse de l'écran tactile. Une autre fenêtre s'ouvrira.

Entrez 15 secondes pour la phase sombre, 100 millisecondes pour la période, 10 millisecondes pour l'impulsion, et un pour le nombre de périodes correspondant à un stimulus unique de 10 millisecondes.

Sur l'écran principal, confirmez que la case stimulation lumineuse est cochée, puis cliquez sur stockage des échantillons, suivi de modifier. Dans la nouvelle fenêtre, utilisez les boutons plus ou moins pour sélectionner deux échantillons à stocker dans chaque canal, et confirmez que la case azote liquide activé est cochée. Maintenant, sous un microscope stéréo, placez un disque en saphir, côté cellules vers le haut, dans la cavité d'une plaque noire centrale.

Suivi d’un anneau espacement de 100 microns. Plonger un côté d’un disque de saphir vierge dans une solution saline préalablement réchauffée et placer le disque au-dessus de l’anneau espacement, le côté saline vers le bas. Placer un autre anneau espacement de 100 microns.

Et un anneau d'espacement de 400 microns placé au-dessus du dernier disque de saphir, puis utilisez du papier filtre pour éliminer tout excès de liquide. En tenant les échantillons, veillez à ne pas emprisonner de bulles d'air entre les disques de saphir. Ensuite, placez l'ensemble entre les deux demi-cylindres transparents et fermez le couvercle supérieur rouge pour initier le processus de congélation.

Le couvercle rouge remontera automatiquement une fois le processus de congélation terminé. Lorsque tous les échantillons ont été congelés, ouvrez la porte du dewar de stockage et transférez le dewar sur le plan de travail. Transférez la chambre à échantillons du dewar de stockage vers un plateau d'échantillonnage spécialisé rempli d'azote liquide.

Déverrouillez le bouton pour libérer le récipient d'échantillon. Ensuite, utilisez une pince aux extrémités refroidies à l'azote liquide pour retirer les demi-cylindres transparents du récipient d'échantillon. Transférez soigneusement les plaques noires centrales vers un petit récipient contenant de l'azote liquide.

Veillez à maintenir les échantillons congelés sous azote liquide en tout temps et à toujours manipuler les échantillons avec des pinces prérefroidies. Refroidissez à nouveau les pinces, puis transférez rapidement la première plaque centrale dans l'acétone prérefroidie. Secouez et tapez délicatement sur la plaque pour séparer le disque de saphir de la plaque.

Ensuite, placez un fichier cryogénique ouvert de fixateur dans une chambre d'échantillons de l'unité de substitution. Transférez le disque en saphir dans le flacon. Et refermez immédiatement le flacon.

Une fois que tous les échantillons ont été transférés, réglez les paramètres appropriés du programme de substitution libre et lancez le programme. À la fin du programme de substitution libre, utilisez des gants pour transférer les fioles cryogéniques de la chambre d'échantillons vers une hotte chimique et utilisez une pipette pour ajouter de l'acétone à température ambiante dans chaque fiole. Remplacez le rinçage dans chaque fiole par de l'acétone fraîche quatre à six fois sur une période d'une à deux heures.

Ensuite, ajouter 30 % de résine époxy fraîchement préparée dans chaque vial pour une incubation de deux à trois heures à température ambiante dans un agitateur orbital à 120 tr/min. À la fin de l'incubation, remplacer la résine époxy à 30 % par de la résine époxy à 70 % pour une incubation de trois à quatre heures dans l'agitateur orbital. Puis utiliser une pince pour transférer chaque disque, côté cellules vers le haut, sur le bouchon d'une capsule d'encapsulation et ajouter de la résine époxy à 90 % sur les disques pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius.

Le lendemain matin, transférez chaque disque en saphir sur le bouchon d'une nouvelle capsule d'encapsulation, puis remplissez le bouchon avec de la résine époxy à 100 % fraîchement préparée. Après la dernière incubation dans la résine époxy à 100 %, polymérisez les échantillons dans un four à 60 degrés Celsius pendant 48 heures. Une fois les échantillons polymérisés, placez le premier échantillon à l'envers sur le microscope stéréo de sorte que le disque en saphir se trouve en haut du bloc de résine, puis utilisez une lame de rasoir pour retirer une fine couche de résine située au sommet de l'échantillon.

Ensuite, utilisez la lame de rasoir pour couper une ligne peu profonde le long du bord du disque afin de séparer le disque de saphir de la résine époxy. Plongez ensuite le disque dans de l'azote liquide pendant environ 10 secondes pour détacher le disque du reste de la résine. Transférez la résine sous un microscope stéréoscopique et fixez l'échantillon sur la platine du microscope à l'aide d'un ruban adhésif.

À l’aide d’un grossissement de 4 à 10X, repérer une zone contenant des cellules et utiliser une lame de rasoir double tranchant pour découper une zone de deux millimètres sur deux autour de la région d’intérêt. Ensuite, utiliser de la colle cyanoacrylate pour monter les cellules sur un bloc cylindrique factice en résine époxy, puis incuber le bloc à 60 degrés Celsius pendant une heure. Après la coupe en sections sur un ultramicrotome, transférer les échantillons dans un microscope électronique en transmission pour l’imagerie à un grossissement de 930 000X.

Dans cette image, la fusion des vésicules synaptiques par exocytose, enregistrée 15 millisecondes après le début de l'illumination dans la zone active d'une membrane présynaptique d'un neurone hippocampique de souris, est montrée. Cent millisecondes après le début de l'illumination, une fossette endocytotique adjacente à la zone active peut être observée, illustrant l'endocytose ultra-rapide par la cellule nerveuse. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de traiter des échantillons à l'aide d'expériences de flash et congélation.

Il est important de rappeler que le travail avec le glutaraldéhyde, le tétraoxyde d'osmium et l'azote liquide peut être extrêmement dangereux ; veillez donc à porter des vêtements de protection. Une fois maîtrisée, la phase de congélation de ce protocole peut être réalisée en quelques heures pour 12 échantillons, mais le reste des procédures, incluant l'imagerie et l'analyse des images, peut prendre plusieurs jours, semaines, voire mois, ce qui peut en faire un protocole très long. Si vous localisez des protéines ou visualisez leurs dynamiques, vous pouvez également utiliser différents protocoles afin de préserver l'antigénicité ou la piérescence provenant de protéines piérescentes, et observer leurs dynamiques à l’aide de ces techniques.